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原文传递一种利用纳米孔检测凝血酶的方法

专利名称：	一种利用纳米孔检测凝血酶的方法
摘要：	本发明公开了一种利用纳米孔检测凝血酶的方法，属于生化分析技术领域。该方法基于一个双链DNA探针。探针由适配体、cDNA‑16和捕获臂组成。通过生物素‑链霉亲和素作用，将该双链DNA探针固定在链霉亲和素磁珠表面，形成的双链DNA‑磁珠复合物作为探针。适配体连接在磁珠上，当凝血酶存在时，适配体与凝血酶特异性结合，然后磁性分离，将捕获臂与cDNA的杂交产物(输出DNA)释放下来。释放的DNA进行纳米孔检测，产生特征性的阻断电流信号。凝血酶的浓度越高，释放的DNA越多，在纳米孔中的阻断电流信号越多，信号频率与凝血酶的浓度成一定的比例关系。所以通过分析信号频率能够实现蛋白质的定量检测。
专利类型：	发明专利
申请人：	临沂大学
发明人：	刘国魁;葛亚仙;刘丽萍;崔梦洁;房真;郗冬梅
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T20:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T10:00:00+0805
申请号：	CN201911321946.7
公开号：	CN110988345A
代理机构：	济南泉城专利商标事务所
代理人：	石运芹
分类号：	G01N33/573;G;G01;G01N;G01N33;G01N33/573
申请人地址：	276000 山东省临沂市兰山区工业大道北段西侧
主权项：	1.一种利用纳米孔检测凝血酶的方法，其特征在于，它包括以下步骤： (1)双链DNA底物探针的制备：分别取适量捕获臂Throm-DNA、cDNA-16和适配体Throm-apt在缓冲液中混合，混合均匀后在95℃反应5分钟，使其充分杂交，再缓慢冷却至室温得到双链反应液，取双链反应液与链霉亲和素磁珠混合，放入恒温振荡器中37℃孵育15分钟，反应结束后磁性分离，去掉上清液，得到与磁珠结合的双链DNA底物探针； (2)凝血酶与底物探针混合孵育反应：向双链DNA底物探针中分别加入不同浓度的凝血酶100μL，放在恒温振荡器中37℃孵育半小时；凝血酶与连接在磁珠上的适配体特异性识别并结合，通过磁性分离获取上清液，取100μL上清液进行α-溶血素纳米孔检测； (3)α-溶血素纳米孔的组装：用000号貂毛笔在1mL trans检测池的小孔内外两侧均匀涂抹磷脂溶液，将cis检测池和trans检测池组装后分别加入1mL电解质溶液，将一对Ag/AgCl电极浸入电解质溶液中，通过电流放大器探头向磷脂双分子层膜两端施加+100mV电压，使用提拉法在trans池的小孔处形成磷脂双分子层膜；在cis检测池中加入α-溶血素，当α-溶血素在磷脂双分子层膜上自组装形成一个稳定的纳米通道时，离子流将量子化阶跃，在+160mV电压条件下，单个纳米孔的稳定开孔电流为160±10pA； (4)利用α-溶血素纳米孔检测输出DNA：将步骤(2)得到的上清液注入cis检测池，在外加电场的驱动下，待测分子逐一通过α-溶血素纳米孔，产生阻断信号；实验产生的电流通过Axopatch 200B放大采集，通过DigitalData1440A数模转换器转换为数字量，并传输到电脑上；通过PClamp 10.6软件实时观测并记录纳米通道单分子实验数据，利用OriginLab 9.0进行数据分析，实现对凝血酶的定量分析检测。 2.根据权利要求1所述的利用纳米孔检测凝血酶的方法，其特征在于，所述步骤(1)中cDNA-16的序列为AACCACACAACCTACC；Throm-DNA的序列为C30GGTAGGTTGTGTGGTTAT(CCC)AGTCACCCCAAC；所述Throm-apt序列为Biotin-T10AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT；其中C30是指30个C，T10是指10个T，Throm-DNA序列中下划线标注的CCC表示接到单链DNA上的分支。 3.根据权利要求1所述的利用纳米孔检测凝血酶的方法，其特征在于，所述步骤(1)中捕获臂Throm-DNA、cDNA-16、适配体Throm-apt的浓度均为10-6M，用量均为20μL；缓冲液用量为20μL。 4.根据权利要求3所述的利用纳米孔检测凝血酶的方法，其特征在于，所述缓冲液组成为150mM NaCl，20mM Tris-HCl，pH 7.9。 5.根据权利要求1所述的利用纳米孔检测凝血酶的方法，其特征在于，所述步骤(1)中双链反应液与链霉亲和素磁珠混合的具体方法为：先用1mL 1×BW缓冲液将50μL磁珠洗三次，然后将25μL双链反应液、25μL超纯水和洗过的磁珠在50μL 2×BW缓冲液中混匀，涡旋15分钟后磁性分离，将上清液倒出，保留磁珠。 6.根据权利要求1所述的利用纳米孔检测凝血酶的方法，其特征在于，所述步骤(2)中双链DNA底物探针用量为100μL，浓度为2×10-7M。 7.根据权利要求1所述的利用纳米孔检测凝血酶的方法，其特征在于，所述步骤(3)中磷脂溶液为30mg/mL的磷脂正葵烷溶液。 8.根据权利要求1所述的利用纳米孔检测凝血酶的方法，其特征在于，所述步骤(3)中电解质溶液cis池中为:1.0M KCl,10mMTris-HCl,1mM EDTA,pH 7.8；trans池中为:1.0MKCl,10mMTris-HCl,1mM EDTA,pH 7.8。 9.根据权利要求1所述的利用纳米孔检测凝血酶的方法，其特征在于，所述步骤(3)中α-溶血素加入量为1μL 5μg/mL。
所属类别：	发明专利