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原文传递一种利用纳米孔同时检测两种肿瘤标志物的方法

专利名称：	一种利用纳米孔同时检测两种肿瘤标志物的方法
摘要：	本发明公开了一种利用纳米孔检测两种肿瘤标志物的方法，属于生化分析技术领域。该方法包括(1)双链DNA底物探针的制备、(2)蛋白质与底物探针混合孵育反应、(3)α‑溶血素纳米孔的组装、(4)利用α‑溶血素纳米孔检测输出DNA，共4个步骤。本发明是基于双链DNA的探针，该探针由核酸适配体、捕获臂以及cDNA组成。本发明一方面可以实现两种蛋白质的准确区分，另一方面通过分析释放DNA的频率可以实现对两种蛋白质的定量检测。本发明的方法可以实现灵敏、高效、免标记、免扩增定量检测PDGF‑BB和VEGF165。
专利类型：	发明专利
申请人：	临沂大学
发明人：	郗冬梅;崔梦洁;房真;葛亚仙;刘丽萍;张书圣
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T20:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T10:00:00+0805
申请号：	CN201911321766.9
公开号：	CN110988347A
代理机构：	济南泉城专利商标事务所
代理人：	石运芹
分类号：	G01N33/574;G01N33/543;G;G01;G01N;G01N33;G01N33/574;G01N33/543
申请人地址：	276000 山东省临沂市兰山区工业大道北段西侧
主权项：	1.一种利用纳米孔同时检测两种肿瘤标志物的方法，其特征在于，它包括以下步骤： (1)双链DNA底物探针的制备：分别取适量捕获臂VEGF165、cDNA-12、适配体VEGF165混匀后在95℃加热5min；同时分别取适量捕获臂PDGF-BB、cDNA-25、适配体PDGF-BB混匀后在95℃加热5min；然后使两种混合液分别缓慢降温至室温得到两种杂交链反应液；分别取两种不同的杂交反应液25μL、25μL超纯水、50μL链霉亲和素磁珠在50μL 2×BW缓冲液中混匀，涡旋15分钟，反应完毕后，磁性分离去掉上清液，得到两种与磁珠结合的双链DNA底物探针，备用； (2)蛋白质与底物探针混合孵育反应：取相同体积的两种双链DNA底物探针混合在一起，然后向里面同时加入两种蛋白质PDGF-BB和VEGF165，放在恒温振荡器中37℃孵育40分钟，反应结束后，用磁铁将磁珠和上清液分开，得到的上清液用于纳米孔检测； (3)α-溶血素纳米孔的组装：用貂毛笔在trans检测池的小孔内外两侧均匀涂抹磷脂溶液；将cis检测池和trans检测池组装后分别加入1M KCl电解质溶液；将一对Ag/AgCl电极浸入电解质溶液中，通过电流放大器探头向磷脂双分子层膜两端施加电压，使用提拉法在trans池的小孔处形成磷脂双分子层膜，在cis检测池中加入α-溶血素，当α-溶血素在磷脂双分子层膜上自组装形成一个稳定的纳米通道时，离子流将量子化阶跃，在+160mV电压条件下，单个纳米孔的稳定开孔电流为160±10pA； (4)利用α-溶血素纳米孔检测输出DNA：将步骤(2)得到的上清液注入cis检测池，在外加电场的驱动下，待测物逐一通过α-溶血素纳米孔，产生阻断信号；实验产生的pA级电流通过电流放大器放大采集，并通过低通滤波器进行滤波，滤波频率为5kHz，放大器采集得到的模拟信号通过数模转换器转换为数字量，并传输到电脑上，通过PClamp 10.6软件实时观测并记录纳米通道单分子实验数据，由于两种释放DNA的长度不同，稳定性不同，穿过α-溶血素纳米孔时产生的特征信号不同，进而实现对两种蛋白质同时进行检测。 2.根据权利要求1所述的利用纳米孔同时检测两种肿瘤标志物的方法，其特征在于，所述步骤(1)中捕获臂VEGF165序列为：C30TGTTGTGTGGTTAATCTACCCGGCCC；cDNA-12序列为：AACCACACAACA；适配体VEGF165序列为： biotin-T10TGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGA。 3.根据权利要求1所述的利用纳米孔同时检测两种肿瘤标志物的方法，其特征在于，所述步骤(1)中捕获臂PDGF-BB序列为： C30GCTGTGGTAGGTTGTGTGGTTGGCGAACAGGATCATGGT；cDNA-25序列为： CGCCAACCACACAACCTACCACAGC；适配体PDGF-BB序列为： biotin-T10CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG。 4.根据权利要求1所述的利用纳米孔同时检测两种肿瘤标志物的方法，其特征在于，所述步骤(1)中捕获臂VEGF165、cDNA-12、适配体VEGF165的浓度均为10-6M，用量均为20μL；所述捕获臂PDGF-BB、cDNA-25、适配体PDGF-BB的浓度均为10-6M，用量均为20μL。 5.根据权利要求1所述的利用纳米孔同时检测两种肿瘤标志物的方法，其特征在于，所述步骤(1)中链霉亲和素磁珠浓度为10mg/mL，直径为1.0μm。 6.根据权利要求1所述的利用纳米孔同时检测两种肿瘤标志物的方法，其特征在于，所述步骤(2)中两种双链DNA底物探针浓度为2×10-7M，体积为100μL；其中蛋白质PDGF-BB加入量为浓度10-10M，体积100μL；VEGF165加入量为10-10M/10-9M/10-8M/10-7M，体积100μL。 7.根据权利要求1所述的利用纳米孔同时检测两种肿瘤标志物的方法，其特征在于，所述步骤(3)a)中涂抹的磷脂溶液为30mg/mL的磷脂正癸烷溶液。 8.根据权利要求1所述的利用纳米孔同时检测两种肿瘤标志物的方法，其特征在于，所述步骤(3)a)中α-溶血素的加入量为1μL 5μg/mL的α-溶血素。
所属类别：	发明专利