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原文传递一种溶解性多糖单加氧酶酶活的检测方法及其应用

专利名称：	一种溶解性多糖单加氧酶酶活的检测方法及其应用
摘要：	本发明涉及一种溶解性多糖单加氧酶的检测方法及其应用。其检测原理为以10‑乙酰基‑3,7‑二羟基吩噁嗪作为底物，辣根过氧化物酶作为辅酶，当溶解性多糖单加氧酶和氧气反应生成过氧化氢时，在辅酶的作用下，和底物反应生成具有荧光的试卤灵。该检测方法不需要额外添加电子供体，提高了反应的稳定性，可用于未纯化产物鉴定，灵敏度高，且检测时间短。利用荧光检测方法检测溶解性多糖单加氧酶酶活还具有检测通量高、准确性高、易于实现自动化、成本低等特点，有利于在筛选工作中进行规模化应用，与流式细胞仪结合使用，可高效快速的筛选到具有高酶活的优良菌种。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	南京工业大学
发明人：	马江锋;成超;姜岷
专利状态：	有效
申请日期：	2019-01-23T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-14T00:00:00+0800
申请号：	CN201910064696.7
公开号：	CN109884004A
代理机构：	江苏致邦律师事务所
代理人：	徐蓓
分类号：	G01N21/64(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	211816 江苏省南京市江北新区浦珠南路30号
主权项：	1.一种溶解性多糖单加氧酶酶活的检测方法，其特征在于，底物10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪和辅酶辣根过氧化物酶混合，加入溶解性多糖单加氧酶后检测荧光放射强度变化。 2.根据权利要求1所述的溶解性多糖单加氧酶酶活的检测方法，其特征在于，具体包括如下步骤：（1）将底物10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪和辅酶辣根过氧化物酶混合，采用PIPES缓冲溶液调节溶液的pH值；（2）将不同浓度的溶解性多糖单加氧酶液分别加入到上述混合溶液中，在一定温度条件下反应一段时间；在激发光560nm，发射光590nm条件下检测荧光，以溶解性多糖单加氧酶的浓度为横坐标，荧光增强速率为纵坐标作图，绘制溶解性多糖单加氧酶酶活的标准曲线；（3）按照步骤（1）、（2）将溶解性多糖单加氧酶粗酶液加入到10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪和辅酶辣根过氧化物酶混合液中，反应后检测荧光，对照标准曲线计算粗酶液酶活。 3.根据权利要求1所述的溶解性多糖单加氧酶酶活的检测方法，所述的步骤（1）中10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪的浓度为10μM，辅酶辣根过氧化物酶浓度为30U/ml，PIPES缓冲溶液浓度为100mM，所述pH值为6 .0。 4.根据权利要求1所述的溶解性多糖单加氧酶酶活的检测方法，步骤（2）所述溶解性多糖单加氧酶酶液的浓度为0-20μg/mL。 5.根据权利要求1所述的溶解性多糖单加氧酶酶活的检测方法，所述的步骤（2）中反应温度为30℃，反应时间为30min。 6.根据权利要求1所述的溶解性多糖单加氧酶酶活的检测方法，其特征在于，该方法检测限1ug/ml。 7.根据权利要求1所述的溶解性多糖单加氧酶酶活的检测方法，其特征在于，向所述步骤(2)中加入抑制剂EDTA会抑制溶解性多糖单加氧酶的酶活。 8.权利要求1所述溶解性多糖单加氧酶酶活的检测方法在溶解性多糖单加氧酶酶活检测以及大规模筛选中的应用。
所属类别：	发明专利