详情

原文传递一种利用纳米金直接标记引物的快速检测非洲猪瘟的试剂盒

专利名称：	一种利用纳米金直接标记引物的快速检测非洲猪瘟的试剂盒
摘要：	本发明公开了一种利用纳米金直接标记引物的快速检测非洲猪瘟的试剂盒。它包括快速检测非洲猪瘟的试纸条、引物对和缓冲溶液；试纸条包括样品吸收垫、反应膜、吸水垫和底板；沿样品流动方向，样品吸收垫、反应膜、吸水垫依次固定于底板上；试纸条的反应膜上包括检测区和质控区；检测区包被链霉亲和素；质控区包被连接有链霉亲和素或生物素的质控探针；引物对为5'端标记纳米金的上游引物和修饰生物素的下游引物。本发明利用纳米金直接标记于特异性PCR引物，借助于双链互补原则，以及普通PCR，降低了试剂盒成本，实现简单快速低成本的现场检测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所
发明人：	陈爱亮;王之莹;李婷婷
专利状态：	有效
申请日期：	2019-02-26T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-14T00:00:00+0800
申请号：	CN201910140489.5
公开号：	CN109884296A
代理机构：	北京纪凯知识产权代理有限公司
代理人：	关畅
分类号：	G01N33/569(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	100081 北京市海淀区中关村南大街12号
主权项：	1.一种快速检测非洲猪瘟的试纸条，包括样品吸收垫、反应膜、吸水垫和底板；沿样品流动方向，所述样品吸收垫、所述反应膜、所述吸水垫依次固定于所述底板上；所述试纸条的反应膜上包括检测区和质控区；所述检测区包被链霉亲和素；所述质控区包被连接有链霉亲和素或生物素的质控探针；所述质控探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。 2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：形成所述检测区的所述链霉亲和素的浓度为4mg/mL~10mg/mL；形成所述质控区的所述链霉亲和素或生物素的浓度可为1mg/mL；所述质控探针的浓度可为100μM；所述质控区包被有链霉亲和素或生物素的质控探针在反应膜上按照如下步骤得到：链霉亲和素或生物素与质控探针在反应膜上室温反应1~2小时。 3.一种快速检测非洲猪瘟的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括快速检测非洲猪瘟的试纸条、引物对和缓冲溶液；所述试纸条包括样品吸收垫、反应膜、吸水垫和底板；沿样品流动方向，所述样品吸收垫、所述反应膜、所述吸水垫依次固定于所述底板上；所述试纸条的反应膜上包括检测区和质控区；所述检测区包被链霉亲和素；所述质控区包被连接有链霉亲和素或生物素的质控探针；所述引物对为5'端标记纳米金的上游引物和修饰生物素的下游引物。 4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述质控探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述的上游引物和所述的下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3；形成所述检测区的所述链霉亲和素的浓度可为4mg/mL~10mg/mL，具体可为5 mg/mL或4mg/mL~8mg/mL；形成所述质控区的所述链霉亲和素或生物素的浓度可为1mg/mL；所述质控探针的浓度可为100μM；所述质控区包被有链霉亲和素或生物素的质控探针在反应膜上按照如下步骤得到：链霉亲和素或生物素与质控探针在反应膜上室温反应1~2小时；所示所述缓冲溶液为TE Buffer。 5.一种利用权利要求3或4所述的试剂盒快速检测非洲猪瘟病毒的方法，包括如下步骤：（1）将待测样品置于具有权利要求3或4所述引物对的PCR扩增体系进行PCR反应，得到扩增产物；（2）所述扩增产物与缓冲溶液混合，然后滴加至所述试纸条的样品吸收垫，检测结果如下： 1）当所述检测区显色，且所述质控区也显色，则所述待测样品检测结果为阳性； 2）当所述检测区不显色，且所述质控区显色，则所述待测样品检测结果为阴性； 3）当所述质控区不显色，则所述试纸条无效，需要用新的所述试纸条重新测定。 6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述待测样品与所述引物对的体积比为1:2；所述扩增产物与所述缓冲溶液的体积比为1:5~9。 7.一种用于非洲猪瘟病毒检测的引物对，其特征在于：该引物对为5'端标记纳米金的上游引物和修饰生物素的下游引物；所述的上游引物和所述的下游引物的的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。 8.根据权利要求7所述的引物对，其特征在于：制备所述5'端标记纳米金的上游引物包括如下步骤：将纳米金胶体溶液与上游引物在避光下放置反应；然后加PB缓冲液，并加NaCl水溶液稀释，放置反应，即得所述5'端标记纳米金的上游引物。 9.根据权利要求8所述的引物对，其特征在于：所述纳米金胶体溶液中纳米金胶体的粒径为13~25nm，所述上游引物的浓度为100μM；所述纳米金胶体溶液与所述上游引物的体积比为25~50：1；在所述避光下放置反应时间为16~24h；所述PB缓冲液的浓度为10mM，所述上游引物与所述PB缓冲液的体积比为1:2.8；加2M NaCl水溶液将体系稀释至0.3M，然后反应的时间为8~12h；得到所述5'端标记纳米金的上游引物的后处理步骤如下：离心，除上清；然后重悬于NaCl水溶液和PB缓冲液中，备用。 10.一种用于非洲猪瘟病毒检测的扩增体系，其特征在于：该体系包括权利要求7或9所述引物对、一种或多种DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液和ddH2O。
所属类别：	发明专利