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原文传递对宿主细胞蛋白质的蛋白质组分析

专利名称：	对宿主细胞蛋白质的蛋白质组分析
摘要：	本文中公开了用于在产物，例如重组蛋白，例如抗体的产生期间检测和/或定量宿主细胞蛋白质的方法和组合物。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	瑞士;CH
申请人：	隆扎有限公司
发明人：	J.格雷厄姆
专利状态：	有效
申请日期：	2017-08-11T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-14T00:00:00+0800
申请号：	CN201780062381.8
公开号：	CN109891244A
代理机构：	北京市柳沈律师事务所
代理人：	张晓飞
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	瑞士菲斯普
主权项：	1.快速分析样品的简单方法，例如以提供蛋白质风险的评估(例如，所述蛋白质在制剂中作为污染物存在时呈现的风险，例如，待施用于受试者的制剂，例如药物制剂)，所述方法包括： a)在使所述样品中的所述蛋白质变性的条件，例如变性剂浓度下，于10-30℃，例如18-26℃，例如20±3℃，20±2℃，20±1℃，或20℃的温度提供样品混合物，例如形成和/或维持样品混合物，所述样品混合物包含： i)经由工艺产生的所述样品，其包含所述蛋白质和任选地产物(例如，重组多肽，例如抗体、酶或细胞因子)；和 ii)变性剂，例如脱氧胆酸盐和尿素； b)在所述酶维持实质活性并与所述蛋白质反应，例如裂解所述蛋白质以提供蛋白质消化产物的条件下提供样品/酶混合物，例如，形成和/或维持样品/酶混合物，所述样品/酶混合物包含： i)样品混合物(例如，来自(a)的样品混合物的等分试样)；和 ii)酶制剂，其包含所述蛋白质为底物的酶，例如蛋白水解酶，例如在所述样品混合物的情况下在预先选择或限定的靶位点处切割蛋白质的酶，例如胰蛋白酶、lysC、GluC或AspN； c)使用层析，例如1维层析分离所述蛋白质消化产物，提供所述蛋白质消化产物的身份，例如通过质谱法，例如LC/MS，并使用一种或多种蛋白质消化产物来提供与所述蛋白质消化产物相关的蛋白质的身份；并且 d)将蛋白质风险得分分配给所述样品中鉴定的蛋白质，从而分析所述样品并且提供蛋白质风险的评估。 2.快速分析样品以提供蛋白质风险评估的简单方法，所述方法包括： a)在使所述样品中的所述蛋白质变性的条件，例如第一变性剂的浓度下，于30-60℃，例如45-55℃，例如50±3℃，50±2℃，50±1℃或50℃的温度提供样品混合物，例如形成和/或维持样品混合物，所述样品混合物包含： i)经由工艺产生的所述样品，其包含所述蛋白质(例如HCP)和任选地治疗产物(例如重组多肽)；和 ii)第一变性剂，例如盐酸胍； b)在所述酶维持实质活性并与所述蛋白质反应，例如裂解所述蛋白质以提供蛋白质消化产物的条件下提供样品/酶混合物，例如，形成和/或维持样品/酶混合物，所述样品/酶混合物包含： i)样品混合物； ii)第二变性剂，例如尿素；和 iii)酶制剂，其包含所述蛋白质为底物的酶，例如蛋白水解酶，例如在所述样品混合物的情况下在预先选择或限定的靶位点处切割蛋白质的酶，例如胰蛋白酶、lysC、GluC或AspN； c)使用层析，例如1维层析分离所述蛋白质消化产物，提供所述蛋白质消化产物的身份，例如通过质谱法，例如LC/MS，并使用一种或多种蛋白质消化产物来提供与所述蛋白质消化产物相关的蛋白质的身份； d)将蛋白质风险得分分配给所述样品中鉴定的蛋白质，从而分析所述样品并提供蛋白质风险的评估。 3.权利要求1或2的方法，其还包括评估多个不同的样品，每个样品由不同工艺制备，例如，评估至少2、4、8、10、50、96、100、192、200、500或1,000个不同的样品。 4.权利要求3的方法，其还包括比较第一和第二不同样品的风险评估。 5.权利要求4的方法，其还包括响应于所述比较，选择用于产生所述产物的工艺。 6.权利要求4的方法，其还包括响应于所述比较，选择、分类或进一步加工所述样品之一。 7.评估制备产物的工艺的方法，例如，并入评估由通过所述工艺产生的除所述产物以外的蛋白质，例如污染物呈现的风险的评估，所述方法包括： a)在使所述样品中的所述蛋白质变性的条件，例如变性剂浓度下，例如于10-30℃，例如18-26℃，例如20±3℃、20±2℃、20±1℃或20℃提供样品混合物，例如形成和/或维持样品混合物，所述样品混合物包含： i)由所述工艺产生的所述蛋白质和任选地产物(例如重组多肽，例如抗体、酶或细胞因子)；和 ii)变性剂，例如脱氧胆酸盐和尿素； b)在所述酶维持实质活性并与所述蛋白质反应，例如裂解所述蛋白质以提供蛋白质消化产物的条件下提供样品/酶混合物，例如形成和/或维持样品/酶混合物，所述样品/酶混合物包含： i)样品混合物(例如，来自a的样品混合物的等分试样)；和 ii)酶制剂，其包含所述蛋白质为底物的酶，例如蛋白水解酶，例如在所述样品混合物的情况下在预先选择或限定的靶位点处切割蛋白质的酶，例如胰蛋白酶、lysC、GluC或AspN； c)分离所述蛋白质消化产物，例如通过使用层析，例如1维层析进行，提供所述蛋白质消化产物的身份，例如通过质谱法，例如LC/MS，并使用一种或多种蛋白质消化产物来提供与所述蛋白质消化产物相关的蛋白质的身份；和 d)将蛋白质风险得分分配给所述样品中鉴定的蛋白质，从而评估制备产物的工艺，例如，并入评估由通过所述工艺产生的除所述产物以外的蛋白质，例如污染物呈现的风险的评估。 8.评估制备产物的工艺的方法，例如，并入评估由通过所述工艺产生的除所述产物以外的蛋白质，例如污染物呈现的风险的评估，所述方法包括： a)在使所述样品中的所述蛋白质变性的条件，例如变性剂的浓度下，于30-60℃，例如45-55℃，例如50±3℃，50±2℃，50±1℃或50℃的温度提供样品混合物，例如形成和/或维持样品混合物，所述样品混合物包含： i)通过所述工艺产生的所述蛋白质和任选地产物(例如重组多肽，例如抗体、酶或细胞因子)；和 ii)第一变性剂，例如盐酸胍； b)在所述酶维持实质活性并与所述蛋白质反应，例如裂解所述蛋白质以提供蛋白质消化产物的条件下提供样品/酶混合物，例如，形成和/或维持样品/酶混合物，所述样品/酶混合物包含： i)样品混合物(例如，来自a的样品混合物的等分试样)； ii)第二变性剂，例如尿素；和 iii)酶制剂，其包含所述蛋白质为底物的酶，例如蛋白水解酶，例如在所述样品混合物的情况下预先选择或限定的靶位点处切割蛋白质的酶，例如胰蛋白酶、lysC、GluC或AspN； c)分离所述蛋白质消化产物，例如通过使用层析，例如1维层析进行，提供所述蛋白质消化产物的身份，例如通过质谱法，例如LC/MS，并使用一种或多种蛋白质消化产物来提供与所述蛋白质消化产物相关的蛋白质的身份；和 d)将蛋白质风险得分分配给所述样品中鉴定的蛋白质，从而评估制备产物的工艺，例如，并入评估由通过所述工艺产生的除所述产物以外的蛋白质，例如污染物呈现的风险的评估。 9.权利要求7或8的方法，所述方法还包括评估制备产物的多个不同工艺，例如，评估至少2、4、8、10、50、96、100、192、200、500或1,000个不同的工艺。 10.权利要求9的方法，其还包括比较第一和第二不同工艺的评估。 11.权利要求10的方法，其还包括：响应于所述比较，选择制备所述产物的工艺。 12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述蛋白质是污染物或其他不期望的组分(例如，由一组条件产生的产物的片段、变性或错误折叠形式，或宿主细胞蛋白质(HCP)或其片段)。 13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述变性剂、第一变性剂或第二变性剂包含脱氧胆酸盐和尿素、盐酸胍、或尿素和盐酸胍，由脱氧胆酸盐和尿素、盐酸胍、或尿素和盐酸胍组成或基本上由脱氧胆酸盐和尿素、盐酸胍、或尿素和盐酸胍组成。 14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述样品混合物中变性剂的浓度高于所述样品/酶混合物中变性剂的浓度。 15.权利要求1-14中任一项的方法，其中：所述样品混合物中变性剂的浓度足够高以使所述蛋白质变性，例如，其中所述蛋白质的至少50、60、70、80、90、95、96、97、98、99、或100％是变性的；且所述样品/酶混合物中变性剂的浓度足够低以不使所述酶变性，例如，其中所述酶的小于50、40、30、20、10、5、4、3、2或1％是变性的。 16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述样品混合物中所述变性剂的浓度为： i)至少1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.5、或8； ii)1-10M、2-9M、3-8M、4-7M、5-7M、6-6.6M、6M、6.6M或8M； iii)0-10M、2-9M、3-8M、4-7M、5-7M、0.5-5M、0.5-2M、0.5M、1M或2M；或 iv)0.01％-50％、1％-40％、1％-20％、0.5％-10％、0.01％-5％、或0.1％-2％(m/v)。 17.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述样品混合物包含第一变性剂(即(a)(ii)的变性剂)，并且所述样品/酶混合物包含所述第一变性剂和第二变性剂。 18.权利要求17的方法，其中所述第一变性剂是盐酸胍，并且所述第二变性剂是尿素。 19.权利要求17或18的方法，其中所述样品混合物中所述第一变性剂的浓度为1-10M、2-9M、3-8M、4-7M、5-7M、6-6.6M、6M、6.6M或8M。 20.权利要求17-19中任一项的方法，其中所述样品/酶混合物中所述第一变性剂的浓度为： i)0-10M、2-9M、3-8M、4-7M、5-7M、0.5-5M、0.5-2M、0.5M、1M或2M； ii)小于或等于4、3.5、3、2.5、2、1.5、1、0.5、或0.1M；或 iii)ii)小于或等于0.5或0.1M，例如基本上为0M。 21.权利要求17-20任一项的方法，其中所述样品/酶混合物中所述第二变性剂的浓度为： i)小于或等于4、3.5、3、2.5、2、1.5、1、0.5、或0.1M； ii)小于或等于0.5或0.1M，例如基本上为0M；或 iii)小于或等于2M或0.5M。 22.权利要求1-21中任一项的方法，其中：所述样品混合物的pH足够低以使脱酰胺反应基本上受抑制，例如，其中所述蛋白质的天冬酰胺和谷氨酰胺侧链的至少50、60、70、80、90、95、96、97、98、99或100％是未改变的，并且所述样品/酶混合物的pH足够高以使所述酶具有活性，例如，其中所述酶为至少50、60、70、80、90、或100％活性的，例如与最大效率相比以50、60、70、80、90、或100％效率起作用。 23.权利要求1-22中任一项的方法，其中所述样品混合物的pH为5.5±1、0.75、0.5、或0.25(例如5.5±0.5)，并且所述样品/酶混合物的pH为7.3±1、0.75、0.5、或0.25(例如7.3±0.5)。 24.权利要求1-23中任一项的方法，其中所述样品混合物的pH为5.5，并且所述样品/酶混合物的pH为7.3。 25.权利要求1-24中任一项的方法，其中所述方法不包括所述蛋白质或蛋白质消化产物的半胱氨酸残基的烷基化。 26.权利要求1-25中任一项的方法，其中所述样品混合物和/或样品/酶混合物包含还原剂，例如三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)或β-巯基乙醇。 27.权利要求26的方法，其中所述样品混合物中还原剂，例如三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)或β-巯基乙醇的浓度高于所述样品/酶混合物中的浓度。 28.权利要求26或27的方法，其中：所述样品混合物中还原剂，例如三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)或β-巯基乙醇的浓度足够高以基本上还原所述蛋白质的半胱氨酸，例如，其中还原所述蛋白质中半胱氨酸残基的至少50、60、70、80、90、95、96、97、98、99、或100％；且所述样品/酶混合物中还原剂，例如三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)或β-巯基乙醇的浓度足够低以不干扰方法或制造方法的其他步骤，例如，其中所述还原剂不在设备(例如，质谱仪或分析柱)中显著积累或者不在数据(例如，质谱法数据)中产生额外的信号。 29.权利要求26-28中任一项的方法，其中所述样品混合物中所述还原剂的浓度为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20mM，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20mM。 30.权利要求26-29中任一项的方法，其中所述样品/酶混合物中所述还原剂的浓度小于或等于10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、或0.1mM，例如10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、或0.1mM。 31.权利要求26-30中任一项的方法，其中所述还原剂是三(2-羧乙基)膦(TCEP)。 32.权利要求1-31中任一项的方法，其中基于大小、电荷或亲和力中的一种或多种(例如，一种、两种、三种或更多种)，分离所述蛋白质消化产物。 33.权利要求1-32中任一项的方法，其中分离所述蛋白质消化产物包括使用层析，例如，1维层析，例如亲和层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、反相层析、疏水相互作用层析、高效液相层析(HPLC)、气相层析(GC)、毛细管电泳、离子迁移率或本文所述的任何层析方法。 34.权利要求1-33中任一项的方法，其中(c)进一步包括提供所述蛋白质消化产物的身份，例如通过质谱法，例如LC/MS，串联质谱法或RP-LCMS2。 35.权利要求1-34中任一项的方法，其中(c)包括使用层析，例如1维层析来分离所述蛋白质消化产物，并提供所述蛋白质消化产物的身份，例如通过质谱法，例如，LC/MS，串联质谱或1D RP-LCMS2。 36.权利要求1-35中任一项的方法，其中对至少2、10、20、96、100、192、1,000、或10,000个样品中的多个，例如，至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100％的蛋白质消化产物分类或分配身份、结构或组成。 37.权利要求1-36中任一项的方法，其中所述蛋白质风险得分是以下一种或多种的函数：接受包含所述蛋白质和任选地产物的制剂的受试者中不想要的性质，例如脱靶性质，例如免疫原性；所述产物的制剂，例如药物制剂中所述蛋白质的不想要的效应，例如引起变性、沉淀或颜色的倾向；和所述样品中存在的所述蛋白质的丰度的值。 38.权利要求1-37中任一项的方法，其中重复步骤(d)以提供所述样品中鉴定的一种或多种(例如，至少2、10、50、100、200、500、1000、或所有)蛋白质的蛋白质风险得分。 39.权利要求1-38中任一项的方法，其中步骤(d)包括提供蛋白质风险得分，例如免疫原性风险得分，例如如由平台产生。 40.权利要求1-39中任一项的方法，其中步骤(d)包括提供如由平台产生的免疫原性风险得分。 41.权利要求1-40中任一项的方法，所述方法还包括向所述样品提供工艺风险得分。 42.权利要求41的方法，其中所述工艺风险得分是所述样品的蛋白质的一种或多种蛋白质风险得分的函数。 43.权利要求41或42中任一项的方法，其中基于以下公式计算所述工艺风险得分：工艺风险得分＝Σ([蛋白质丰度]×[免疫原性风险得分])。 44.权利要求41-43中任一项的方法，其中重复所述方法以分析多个样品，例如，至少2、10、50、96、10、192、或1000，并且其中使用不同的制造工艺或方法提供两个或更多(例如，所有)样品，并且其中为多个样品(例如，所有样品)提供工艺风险得分，或者其中在制造工艺或方法期间的不同时间点提供两个或更多(例如，所有)样品，并且其中为多个样品(例如，所有样品)提供工艺风险得分。 45.权利要求41-44中任一项的方法，所述方法包括将制造工艺或方法，例如用于提供所述样品的制造工艺或方法的工艺风险得分与参考进行比较。 46.权利要求41-45中任一项的方法，所述方法包括将第一制造工艺或方法的工艺风险得分与第二制造工艺或方法的工艺风险得分进行比较。 47.权利要求41-45中任一项的方法，所述方法包括将第一时间点的工艺的工艺风险得分与第二时间点的工艺的工艺风险得分进行比较。 48.权利要求46的方法，所述方法包括响应于所述比较，选择制造工艺或方法之一，例如用于进一步分析或进一步使用，例如以制备产物，例如重组多肽。 49.数据库(例如，计算机可读介质上记忆或记录)，其包含鉴定HCP或蛋白质消化产物特征的文库和源自细胞培养物(例如，CHO细胞培养物，例如，GS-CHO细胞培养物)的细胞培养物上清液的蛋白质风险得分。
所属类别：	发明专利