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原文传递微波萃取-固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测畜禽粪便中7种结合态雌激素的方法

专利名称：	微波萃取-固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测畜禽粪便中7种结合态雌激素的方法
摘要：	本发明涉及一种微波萃取‑固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测畜禽粪便中7种结合态雌激素的方法。该方法为：(1)粪便样品预处理，分别加入17β‑雌二醇D3 3‑β‑D‑葡糖苷酸、17β‑雌二醇硫酸钠‑D4这两种指示回收率的内标物；再经提取溶剂微波萃取、过滤收集提取液，用水稀释，调pH值；(2)固相萃取富集净化目标雌激素；(3)采用内标法，用液质联用仪定量检测畜禽粪便中7种结合态雌激素。该方法通过对提取方法、富集净化条件、液质检测条件进行优化，同时通过选用合适的内标物，可一次性同时检测出畜禽粪便中7种结合态雌激素的残留情况，具有高回收率、高灵敏度、高稳定性、低检测限、检测结果更真实可靠等优点。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	上海;31
申请人：	上海市环境科学研究院
发明人：	张洪昌;沈根祥;胡双庆;郭春霞;钱晓雍;李贞金;王真;张紫琴
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-26T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-18T00:00:00+0800
申请号：	CN201910232317.0
公开号：	CN109900843A
代理机构：	上海精晟知识产权代理有限公司
代理人：	冯子玲
分类号：	G01N30/08(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	200030 上海市徐汇区钦州路508号
主权项：	1.一种微波萃取-固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测中粪便中7种结合态雌激素的方法，其特征在于，按以下步骤进行： (1)结合态雌激素的提取：微波萃取称取经冷冻干燥、粉碎、过筛后的畜禽粪便样品，加入指示回收率的内标物，再加入提取溶剂，经微波萃取、过滤后收集提取液，用超纯水稀释，调节pH值；所述的指示回收率的内标物为17β-雌二醇D3 3-β-D-葡糖苷酸、17β-雌二醇硫酸钠-D4； (2)富集净化：固相萃取依次用等体积的甲基叔丁基醚、甲醇、超纯水活化固相萃取柱，将经步骤(1)处理过的样品过柱，控制样品过柱流速；富集完后，用淋洗液淋洗固相萃取柱，并真空干燥固相萃取柱；再用一定体积的甲醇洗脱目标物，洗脱液再经过甲醇活化过的氨基柱进行净化，经氮吹仪吹干，获得残渣；将残渣用一定浓度的有机溶剂溶解、定容、超声、过滤后转移至进样瓶，待测； (3)高效液相色谱串联质谱法测定畜禽粪便中7种结合态雌激素的含量采用内标法，用高效液相色谱串联质谱仪，定量检测经步骤(2)处理得到的进样瓶内的待测样品中从畜禽粪便中富集到的7种结合态雌激素的含量；所述的7种结合态雌激素分别为：雌酮3-(BETA-D-葡糖苷酸)钠盐、17β-雌二醇17-硫酸钾盐、BETA-雌二醇3-硫酸钠盐、17β-雌二醇3-(β-D-葡糖苷酸)钠盐、雌三醇-3-O-β-D葡糖苷酸钠盐、雌酮3-硫酸钠、17β-雌二醇17-β-D葡糖苷酸。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，微波萃取前分别加入100ng的17β-雌二醇D3 3-β-D-葡糖苷酸、17β-雌二醇硫酸钠-D4这两种内标物指示回收率。 3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的提取溶剂，是甲醇:pH＝5的柠檬酸缓冲溶液体积比为1:1的甲醇与pH＝5的柠檬酸缓冲溶液的混合溶液；采用CEM MARS CLASSIC型微波萃取仪进行萃取，提取粪便中的结合态雌激素；畜禽粪便样品过滤所用的筛网为孔径0.25mm的筛网；微波萃取后过滤提取液所用的玻璃纤维滤膜孔径为0.45μm、0.47μm或0.7μm；稀释后的样品pH值调至3-4。 4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，活化固相萃取柱所用的甲基叔丁基醚、甲醇和超纯水用量为5-10mL；活化氨基柱所用的甲醇用量为3-6mL；淋洗固相萃取柱所用的淋洗液依次为低浓度甲醇水溶液、超纯水、体积浓度比为2:10:88的氨水-甲醇-水各5-10mL；真空干燥的时间在20-30min；洗脱固相萃取柱时的流速低于10mL/min。 5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，富集所用的固相萃取柱为Waters公司Oasis HLB小柱，它是一种亲水-亲脂性聚合物填料柱，其吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，是用于酸性、中性和碱性化合物的通用型吸附剂；净化所用的氨基柱为Waters公司NH2 Cartridges柱，它具有极性固定相和弱阴离子交换剂，可通过弱阴离子交换或极性吸附达到保留作用；样品过柱流速不超过5mL/min；活化固相萃取柱的流速不超过5mL/min。 6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，淋洗固相萃取柱所用的低浓度甲醇为体积浓度小于10％的甲醇-水溶液；残渣用有机溶剂溶解、定容后，超声5-10min；用针式滤器过滤至棕色进样小瓶；针式滤器选用孔径小于0.22μm的聚四氟乙烯针式滤头。 7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，溶解氮吹后残留物质的有机溶剂为甲醇或乙腈，或体积浓度为70-80％的甲醇-水溶液，或体积浓度为70-80％的乙腈-水溶液。 8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，选用美国AB公司的AB5500Q-trap高效液相色谱串联质谱仪，配岛津30A液相色谱，对7种结合态雌激素进行检测；液相色谱的色谱柱选用Shim-Pack XR-ODSII C18柱型号75mm×2mm，1.0μm。 9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，色谱柱柱温40℃；进样量4μL；进样室温度10℃；流动相流速0.3mL·min-1；流动相A为体积浓度为0.1％的氨水-水溶液，其中的水为Milli-Q超纯水；流动相B为乙腈；梯度洗脱程序为：0-2min，10％B；2.0-2.2min，10％B-50％B；2.2-3.5min，50％B；3.5-3.8min，50％B-97％B；3.8-5.5min，97％B；5.5-5.6min，97％B-10％B；10min，10％B。 10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，质谱检测条件为：电喷雾离子源负离子模式ESI-，三重四级杆质量分析器，扫描方式：多反应监测模式MRM进行检测；离子源温度为550℃，离子化电压为-4500V，气帘气CUR为35psi，喷雾气GS1为50psi，辅助加热气GS2为50psi，碰撞气CAD为Medium，碰撞气为高纯氮气。
所属类别：	发明专利