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原文传递一种转Bt蛋白食品中Bt蛋白的定量检测方法

专利名称：	一种转Bt蛋白食品中Bt蛋白的定量检测方法
摘要：	本发明公开了一种转Bt蛋白食品中Bt蛋白的定量检测方法，采用胰蛋白酶对转Bt蛋白食品进行酶解，选择Bt蛋白酶解产生的多肽中的特异性多肽作为标志物，人工合成该特异性多肽作为标准物质，设计并合成同位素标记的特异性多肽作为内标，采用同位素稀释液相色谱串联质谱法对特异性多肽进行定量检测，然后换算得Bt蛋白含量。本发明稳定性好、定量准确、重复性好、特异性高、适用性广。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	杭州老爸评测科技有限公司
发明人：	魏文锋;李炀;陈一鸣;王梓昂
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-13T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-21T00:00:00+0800
申请号：	CN201910187579.X
公开号：	CN109917032A
代理机构：	杭州知见专利代理有限公司
代理人：	赵越剑
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	310000 浙江省杭州市滨江区西兴街道阡陌路459号C楼C2-701室
主权项：	1.一种转Bt蛋白食品中Bt蛋白的定量检测方法，其特征在于：采用胰蛋白酶对转Bt蛋白食品进行酶解，选择Bt蛋白酶解产生的多肽中的特异性多肽作为标志物，人工合成该特异性多肽作为标准物质，设计并合成同位素标记的特异性多肽作为内标，采用同位素稀释液相色谱串联质谱法对特异性多肽进行定量检测，然后换算得Bt蛋白含量。 2.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于：采用胰蛋白酶对转Bt蛋白食品进行酶解具体操作如下：精确称取0.1g样品于2ml EP管，加入900mg碳酸氢铵溶液，再加入10mg DTT，50℃水浴30min，再加入30mg IAA暗处反应30min，最后加入10mg胰蛋白酶，在37℃水浴酶解4h，酶解结束后取出，加入20mg 10％甲酸终止反应，最后加入人工合成的同位素标记特异性多肽10mg混匀。 3.根据权利要求2所述的定量检测方法，其特征在于：碳酸氢铵溶液浓度为50mM，DTT浓度为100mM，IAA浓度为100mM，胰蛋白酶浓度为500mM，人工合成的同位素标记特异性多肽浓度为1000μg/kg。 4.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于：用于检测Bt蛋白Cry1家族的特异性多肽的氨基酸序列为：EKLEWETNIVYK；用于检测Bt蛋白Cry2家族的特异性多肽的氨基酸序列为：TYMFLNVFEYVSIWSLFK。 5.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于：用于同时检测Bt蛋白Cry1家族和Cry2家族的特异性多肽的氨基酸序列为：TFEAEYDLERA。 6.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于：用于检测Bt蛋白Cry3家族的特异性多肽的氨基酸序列为：IRELFSQAESHFR；用于检测Bt蛋白Cry4家族的特异性多肽的氨基酸序列为：IDESKLKPYTR；用于检测Bt蛋白Cry5家族的特异性多肽的氨基酸序列为：NLEKGINAGTYSK；用于检测Bt蛋白Cry9家族的特异性多肽的氨基酸序列为：KMLLEAVR。 7.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于：用于同时检测Bt蛋白Cry3家族、Cry4家族和Cry5家族的特异性多肽的氨基酸序列为：MLALSNRMQK。 8.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于：同位素稀释液相色谱串联质谱法的色谱条件为：使用C18蛋白分析柱，A相为0.1％甲酸水溶液，B相为0.1％甲酸乙腈溶液；洗脱条件为B相0-9min从3％到30％，9-10min从30％到40％，10.1min升到100％保持到10.6min，10.7min回到3％保持到13min。总洗脱时间为13min，流速为0.3mL/min。 9.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于：同位素稀释液相色谱串联质谱法的质谱条件为：毛细管电压：3.0kv，脱溶剂温度：550℃，脱溶剂气流量：400L/min，锥孔反吹气流量：30L/hr，碰撞室压力：3.0×10-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，离子能量1：0.6eV；低端分辨率2：2.0V，高端分辨率2：15.0V，离子能量2：2.0eV；离子源温度：150℃，提取器电压：5.0V，入口透镜电压：10V，出口电压：10V。 10.一种转Bt蛋白食品中Bt蛋白的定量检测盒，其特征在于：包括胰蛋白酶、碳酸氢铵溶液、DTT、IAA、10％甲酸及用于检测Bt蛋白的特异性多肽，用于检测Bt蛋白的特异性多肽具体如下：用于检测Bt蛋白Cry1家族的特异性多肽的氨基酸序列为：EKLEWETNIVYK；用于检测Bt蛋白Cry2家族的特异性多肽的氨基酸序列为：TYMFLNVFEYVSIWSLFK；用于同时检测Bt蛋白Cry1家族和Cry2家族的特异性多肽的氨基酸序列为：TFEAEYDLERA；用于检测Bt蛋白Cry3家族的特异性多肽的氨基酸序列为：IRELFSQAESHFR；用于检测Bt蛋白Cry4家族的特异性多肽的氨基酸序列为：IDESKLKPYTR；用于检测Bt蛋白Cry5家族的特异性多肽的氨基酸序列为：NLEKGINAGTYSK；用于检测Bt蛋白Cry9家族的特异性多肽的氨基酸序列为：KMLLEAVR；用于同时检测Bt蛋白Cry3家族、Cry4家族和Cry5家族的特异性多肽的氨基酸序列为：MLALSNRMQK。
所属类别：	发明专利