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原文传递针对HPV 16和HPV 18基因型的引物对、双重侧向流层析试纸条及检测方法

专利名称：	针对HPV 16和HPV 18基因型的引物对、双重侧向流层析试纸条及检测方法
摘要：	本发明公开了一种针对HPV 16和HPV 18基因型的引物对、双重侧向流层析试纸条及检测方法。所述针对HPV 16基因型的引物对的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。针对HPV 18基因型的引物对的序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。所述双重侧向流层析试纸条包括支撑板，所述支撑板的上端面包括依次设置的上样区、结合有FITC抗体偶联的乳胶微球的标记区、划线区及吸水区，所述划线区内设置有分别结合有链霉亲和素、地高辛抗体和二抗的检测线T1、T2和质控线C。本发明公开的检测方法特异性好，灵敏度高，特异性好，重复性好，操作简单，适用性强。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	安徽;34
申请人：	安徽深蓝医疗科技股份有限公司
发明人：	张超;陈伟;陈奉玲;秦盼柱
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-22T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-21T00:00:00+0800
申请号：	CN201910221549.6
公开号：	CN109917132A
代理机构：	南京利丰知识产权代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：	王茹;王锋
分类号：	G01N33/574(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	230000 安徽省合肥市高新区创新大道106号明珠产业园一期1#厂房D区四层
主权项：	1.一种针对HPV16基因型的引物对，其特征在于包括第一引物和第二引物，所述第一引物、第二引物的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，且所述第一引物的5’端经FITC标记，所述第二引物的5’端经生物素标记。 2.一种针对HPV18基因型的引物对，其特征在于包括第三引物和第四引物，所述第三引物、第四引物的序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，且所述第三引物的5’端经FITC标记，所述第四引物的5’端经地高辛标记。 3.一种同时检测HPV16和HPV18基因型的双重侧向流层析试纸条，包括支撑板，其特征在于：所述支撑板的上端面包括沿设定方向依次设置的上样区、结合有FITC抗体偶联的乳胶微球的标记区、划线区及吸水区，所述划线区内设置有检测线T1、T2和质控线C，且所述检测线T1、T2和质控线C分别结合有链霉亲和素、地高辛抗体和二抗。 4.根据权利要求3所述的同时检测HPV16和HPV18基因型的双重侧向流层析试纸条，其特征在于：所述FITC抗体选自FITC的单克隆抗体，浓度为1.0～5.0mg/mL；和/或，所述乳胶微球为红色或蓝色，粒径为50～200nm；和/或，所述链霉亲和素的浓度为0.5～1.0mg/mL；和/或，所述地高辛抗体选自地高辛的单克隆抗体，浓度为0.6～1.2mg/mL；和/或，所述二抗选自FITC抗体的羊抗鼠抗体，浓度为1.0～5.0mg/mL。 5.根据权利要求3所述的同时检测HPV16和HPV18基因型的双重侧向流层析试纸条，其特征在于：所述支撑板包括不吸水或疏水的纸板或塑料板；和/或，所述上样区的材质包括玻璃纤维棉或聚酯膜；和/或，所述划线区的材质包括硝酸纤维素膜或纯纤维素膜；和/或，所述吸水区的材质包括滤纸。 6.权利要求3-5中任一项所述的同时检测HPV16和HPV18基因型的双重侧向流层析试纸条的制备方法，其特征在于包括：将FITC抗体与羧基修饰的乳胶微球偶联，制得FITC抗体偶联的乳胶微球；将FITC抗体偶联的乳胶微球施加于标记区，将链霉亲和素、地高辛抗体和二抗分别制成划线区的检测线T1、T2以及质控线C；以及，将上样区、标记区、划线区和吸水区沿设定方向依次设置在支撑板上，获得所述的双重侧向流层析试纸条。 7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于具体包括：使包含乳胶微球、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的混合体系于室温避光活化30～40min，之后加入FITC抗体孵育，再加入BSA溶液，获得FITC抗体偶联的乳胶微球；优选的，所述乳胶微球表面所含羧基、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：1：1～1：15：15。 8.权利要求1所述的针对HPV16基因型的引物对、权利要求2所述的针对HPV18基因型的引物对或权利要求3-5中任一项所述的同时检测HPV16和HPV18基因型的双重侧向流层析试纸条于制备检测HPV16和HPV18基因型的产品中的用途。 9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，应用所述产品检测HPV16和HPV18基因型的方法包括：提取待检测HPV样品中的DNA；采用权利要求1所述的针对HPV16基因型的引物对、权利要求2所述的针对HPV18基因型的引物对进行PCR扩增，获得双功能化的双链DNA产物；将所获双链DNA产物加入权利要求3-5中任一项所述的双重侧向流层析试纸条进行检测，根据检测线的显色结果实现待检测HPV样品中HPV16或HPV18的定性或定量检测。 10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，应用所述产品检测HPV16和HPV18基因型的方法具体包括：采用细胞裂解液和蛋白酶K溶液使待检测HPV样品裂解，再加入羧基修饰的磁珠和包被液，所获DNA经洗涤液洗涤，之后以重悬液重悬，获得检测HPV样品的DNA；优选的，所述裂解液包含Tris-HCl缓冲液、乙二胺四乙酸、氯化钠和十二烷基硫酸钠，其中，所述Tris-HCl缓冲液的pH值为7.0～8.0，浓度为10～100mmol/L，所述乙二胺四乙酸的浓度为1～20mmol/L，所述氯化钠的浓度为100～500mmol/L，所述十二烷基硫酸钠与裂解液的质量体积比为0.5～2g：100mL；优选的，所述蛋白酶K溶液的终浓度为0.5～3mg/mL；优选的，所述包被液包含聚乙二醇和氯化钠，其中，所述聚乙二醇的质均分子量为200～20000，所述聚乙二醇与包被液的质量体积比为5～30g：100mL，所述包被液中氯化钠的浓度为0.5～3mol/L；优选的，所述洗涤液包括乙醇含量为50～80vt％的水溶液；优选的，所述重悬液包括Tris-HCl缓冲液和乙二胺四乙酸，其中，所述Tris-HCl缓冲液的pH值为7.0～8.0，浓度为10～100mmol/L，所述乙二胺四乙酸的浓度为1～20mmol/L。
所属类别：	发明专利