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原文传递一种雌激素干扰物固相萃取亲和柱及其制备方法和应用

专利名称：	一种雌激素干扰物固相萃取亲和柱及其制备方法和应用
摘要：	本公开涉及一种利用雌激素受体结合元件提高富集净化效率的检测雌激素干扰物固相萃取亲和柱的制备方法和应用，属于物质检测的样品前处理技术领域，步骤为：硅胶的酸化预处理，预处理后的硅胶与磺酰氯反应得到氯化硅胶，氯化硅胶与己二酸得到羧基化硅胶，羧基化硅胶与雌激素受体结合元件结合，雌激素受体结合元件与雌激素受体结合后装填入固相萃取空柱管中得到固相萃取亲和柱；所述雌激素受体结合元件为与雌激素受体结合的DNA分子。利用雌激素受体结合元件保持雌激素受体的天然活性，可显著提高固相萃取方法的富集净化效率，有助于其与高效液相色谱联用检测方法的广泛应用。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山东;37
申请人：	山东师范大学
发明人：	张鸿雁;张景华;臧利国;王晓文
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-21T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-28T00:00:00+0800
申请号：	CN201910219012.6
公开号：	CN109946409A
代理机构：	济南圣达知识产权代理有限公司
代理人：	张晓鹏
分类号：	G01N30/08(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	250014 山东省济南市历下区文化东路88号
主权项：	1.一种利用雌激素受体结合元件提高富集净化效率的雌激素干扰物固相萃取亲和柱的制备方法，其特征在于：步骤为：硅胶的酸化预处理，预处理后的硅胶与磺酰氯反应得到氯化硅胶，氯化硅胶与己二酸得到羧基化硅胶，羧基化硅胶与雌激素受体结合元件结合，雌激素受体结合元件与雌激素受体结合后装填入固相萃取空柱管中得到固相萃取亲和柱；所述雌激素受体结合元件为一种与雌激素受体结合的DNA分子；优选的，DNA分子的序列为5’-GTCAGGTCACAGTGACCTGATCAAAGTTAATG-3’。 2.一种利用雌激素受体结合元件提高富集净化效率的检测雌激素干扰物的固相萃取亲和柱的制备方法，其特征在于：具体步骤为： 1)硅胶与酸液混合后进行加热回流，过滤，洗涤，烘干得到预处理后的硅胶； 2)预处理后的硅胶溶于有机溶剂A中，加入磺酰氯混合，将得到的产物进行洗涤、烘干得到氯化硅胶； 3)将步骤2)得到的氯化硅胶与己二酸、有机溶剂B、吡啶混合后加热反应，将得到的产物过滤、洗涤得到羧基化硅胶； 4)将羧基化硅胶活化后与雌激素受体结合元件混合反应，将产物用超纯水、封闭剂A洗涤得到羧基化硅胶偶联雌激素受体结合元件； 5)羧基化硅胶偶联雌激素受体结合元件与雌激素受体混合孵育，将产物用超纯水、封闭剂B洗涤、超纯水洗涤，洗涤后将得到的产品装入固相萃取空柱管中得到固相萃取亲和柱；优选的，步骤1)中盐酸质量百分数为8～12％；优选的，1g硅胶对应的盐酸的体积为8～15mL；优选的，回流的温度为100～110℃；优选的，回流的时间为6～10h；优选的，烘干的温度为100～120℃，烘干的时间为22～26h；优选的，步骤2)中1g硅胶对应的无水吡啶、磺酰氯的体积为5～7mL、1.5～2.5mL；优选的，步骤2)中产物进行洗涤的洗涤剂依次为甲苯和无水硫酸钠的混合物、甲醇、丙酮；优选的，步骤2)中烘干的温度为100～120℃，烘干的时间为22～26h；优选的，步骤3)中氯化硅胶与己二酸、甲苯、吡啶的质量比为1:1:5:6；优选的，步骤3)中加热反应的温度为100～120℃，加热反应的时间为10～14h；优选的，步骤4)中将羧基化硅胶活化的活化剂为EDC/NHS；优选的，步骤4)中活化的时间为1.5～2.5h；优选的，步骤4)中所述雌激素受体结合元件为雌激素受体结合DNA，所述雌激素受体结合DNA的序列为5’-GTCAGGTCACAGTGACCTGATCAAAGTTAATG-3’；优选的，1mg羧基化硅胶对应的雌激素受体结合元件的质量为6～7μg；优选的，步骤4)中孵育的时间为1.5～2.5h；优选的，步骤4)中封闭剂A为牛肉血清蛋白或卵清蛋白中，进一步优选的，牛肉血清蛋白的质量百分比为2～4％；优选的，1mg羧基化硅胶偶联雌激素受体结合元件对应封闭剂A的体积为28～32μL；优选的，偶联有雌激素受体结合元件的硅胶与封闭剂A反应的时间为1.5～2.5h；优选的，步骤5)中雌激素受体的浓度为4～6mg/mL；优选的，步骤5)中孵育的时间为0.5～4h。 3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤5)中羧基化硅胶偶联雌激素受体结合元件与雌激素受体的质量比为40:1～2。 4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤5)中封闭剂B为三苯甲胺；优选的，封闭剂B的浓度为0.02～0.1mg/mL；优选的，1mg羧基化硅胶偶联雌激素受体结合元件的质量对应的封闭剂B的体积为28～32μL。 5.权利要求1-4任一项所述的制备方法制备得到的固相萃取亲和柱。 6.权利要求5所述的固相萃取亲和柱在检测雌激素干扰物中的应用。 7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述雌激素干扰物为17β-雌二醇、双酚A、己烯雌酚或农兽药残留中的具有雌激素特性的小分子物质。 8.利用权利要求5所述的固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物的方法，其特征在于：具体步骤为： 1)将雌激素干扰物注入上述固相萃取亲和柱中，依次用超纯水、洗脱剂洗涤固相萃取亲和柱，收集洗脱液； 2)利用高效液相色谱对步骤1)得到的洗脱液进行检测。 9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤1)中洗脱剂为甲醇的水溶液，甲醇的质量分数为35～45％。 10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤2)中高效液相色谱的检测条件为流动相为40～50％乙腈，柱温为25～35℃，流动相流速为0.7～1.3mL/min，进样体积为18～22μL。
所属类别：	发明专利