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原文传递一种快速检测猪流行性腹泻病毒的荧光试纸及制备和应用

专利名称：	一种快速检测猪流行性腹泻病毒的荧光试纸及制备和应用
摘要：	本发明公开一种快速检测猪流行性腹泻病毒的荧光试纸，包括硬质聚氯乙烯底板、硝酸纤维素膜、样品垫、荧光标记物垫、吸水纸，荧光标记物垫上喷涂有抗PEDV的单克隆抗体Ⅰ－量子点荧光标记物，硝酸纤维素膜上喷涂有抗PEDV的单克隆抗体Ⅱ检测线和山羊抗鼠IgG的质控线；抗PEDV的单克隆抗体Ⅰ由杂交瘤细胞10F10分泌产生，抗PEDV的单克隆抗体Ⅱ由杂交瘤细胞4A11分泌产生。本发明还提供了上述试纸的制备方法和应用方法，制备的试纸操作简单、检测快速、灵敏、特异性强、结果清晰易于判断，仅需要一个简易的激发设备，无需专业人员操作，适用于现场诊断。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	湖北;42
申请人：	武汉科前生物股份有限公司
发明人：	张弛;周艳君;但汉并;董晓辉;贾慧勤;李盼盼;范俊青;周云朵
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-04T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-28T00:00:00+0800
申请号：	CN201910160544.7
公开号：	CN109946458A
代理机构：	南京纵横知识产权代理有限公司
代理人：	徐瑛;祝蓉蓉
分类号：	G01N33/569(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	430000 湖北省武汉市东湖新技术开发区高新2路419号
主权项：	1.一种快速检测猪流行性腹泻病毒的荧光试纸，包括硬质聚氯乙烯底板、硝酸纤维素膜、样品垫、荧光标记物垫、吸水纸，所述硝酸纤维素膜粘贴在硬质聚氯乙烯底板上，在硝酸纤维膜的一端粘贴有荧光标记物垫，在荧光标记物垫上粘贴有样品垫，吸水纸置于硝酸纤维素膜的另一端，其特征在于，所述荧光标记物垫上喷涂有抗PEDV的单克隆抗体Ⅰ－量子点荧光标记物，所述硝酸纤维素膜上喷涂有抗PEDV的单克隆抗体Ⅱ的检测线和山羊抗鼠IgG的质控线。 2.根据权利要求1所述的快速检测猪流行性腹泻病毒的荧光试纸，其特征在于，所述抗PEDV的单克隆抗体Ⅰ由杂交瘤细胞10F10分泌产生，所述的杂交瘤细胞10F10保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，其菌种保藏编号为CCTCC NO:C201905。 3.根据权利要求1所述的快速检测猪流行性腹泻病毒的荧光试纸，其特征在于，所述抗PEDV的单克隆抗体Ⅱ由杂交瘤细胞4A11分泌产生，所述的杂交瘤细胞4A11保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，其菌种保藏编号为CCTCC NO:C201904。 4.权利要求1～3任一项所述的快速检测猪流行性腹泻病毒的荧光试纸的制备，其特征在于，包括以下步骤： S1、标记抗PEDV单克隆抗体Ⅰ胶体金的步骤为： S11、配置试剂：分别取1g EDC和NHS各自溶于100ML纯水，配置成10mg/mL的EDC和NHS的工作母液，4℃下保存； S12、活化量子点荧光：取500μL量子点荧光用纯水稀释至1㎎/ml，将EDC和NHS的工作母液稀释为1mg/mL的EDC和NHS的工作液，分别加入87.5μL的EDC工作液和53.3μL的NHS工作也，避光常温混匀30min，得活化量子点荧光； S13、取pH值为8.7且浓度为0.02mol/L的PBS缓冲液，以及体积百分浓度分别为20％的海藻糖、20％的蔗糖、0.5％的吐温-20、0.5％的BSA，搅匀过滤后取得复溶液； S14、取1mL活化的量子点荧光加入66μL浓度为1㎎/mL的抗PEDV的单克隆抗体Ⅰ，避光常温混匀1h；再加入100μL体积百分比浓度为10％的BSA，避光常温混匀2h，13000rpm/min下离心30min，去上清后加入1mL复溶液溶解，4℃保存，得标记的抗PEDV单克隆抗体Ⅰ胶体金； S2、制备抗PEDV的单克隆抗体Ⅰ－量子点荧光标记物垫的步骤为： S21、配制包被液Ⅰ：取浓度为0.015mol/L的PBS缓冲液，以及体积百分浓度为0.5％的BSA、2.0％的海藻糖、2％的吐温-20，搅匀过滤得包被液Ⅰ； S22、制备荧光标记物垫：将玻璃纤维素膜浸泡在上述包被液Ⅰ中30min，37℃下烘干；将标记的抗PEDV单克隆抗体Ⅰ胶体金稀释8倍后喷涂于处理过的玻璃纤维素膜上，喷量为10μL/cm，37℃下烘干2h，裁切成宽0.5cm条状的荧光标记物垫； S3、喷涂检测线和质控线的步骤为： S31、配制包被液Ⅱ：取pH值为7.2且浓度为0.02mol/L的PBS缓冲液，以及体积百分数浓度为1.0％的海藻糖、1.0％的山梨醇、0.3％的吐温-20、搅匀后用0.22μm的滤膜过滤，得包被液Ⅱ； S32、将硝酸纤维素膜非点样面粘贴于聚氯乙烯底板上，将抗PEDV的单克隆抗体Ⅱ用包被液Ⅱ稀释至浓度为0.5mg/mL，然后喷涂于硝酸纤维素膜上作为检测线，喷量为0.8μL/cm；将浓度为1.5mg/mL的羊抗鼠IgG喷涂在硝酸纤维素膜上作为质控线，喷量为0.8μL/cm；37℃下烘干2h备用； S4、处理样品垫，将吸水纸浸泡在由浓度为0.015mol/L的PBS以及体积百分浓度为2.5％蔗糖和2％BSA组成的PBS缓冲液中30min，37℃下烘干，裁切成宽为1.8cm条状备用，得样品垫； S5、试纸的组装、切割和包装，在硬质聚氯乙烯底板上依次粘贴有样品垫、荧光标记物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，样品垫部分覆盖在荧光标记物垫上，荧光标记物垫部分覆盖在硝酸纤维素膜上，吸水纸部分覆盖在硝酸纤维素膜上；荧光标记物垫与硝酸纤维素膜上的检测线相邻，吸水纸与硝酸纤维素膜上的质控线相邻；切成3.6mm宽得试纸成品。 5.权利要求1～3任一项所述的快速检测猪流行性腹泻病毒的荧光试纸的制备，其特征在于，步骤S32中，检测线和质控线的距离是5mm。 6.权利要求1～3任一项所述的快速检测猪流行性腹泻病毒的荧光试纸的应用，其特征在于，包括以下步骤： P1、样品的预处理：取少量待测样本加至pH值为7.4，浓度为1mL的0.01mol/LPBS缓冲液中，搅匀后静置或离心，取上清液； P2、检测：取75μL上清液滴在荧光试纸上，15min后放入便携检测仪中观察结果； P3、结果判定：质控线、检测线上均出现橙色荧光时为阳性，即待测样本中含有猪流行性腹泻病毒；质控线出现橙色荧光、检测线不出现橙色荧光为阴性结果，即样本中不含有猪流行性腹泻病毒；质控线未出现橙色荧光，则试纸无效。
所属类别：	发明专利