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原文传递猪流行性腹泻病毒荧光定量检测试纸条及其制备方法和应用

专利名称：	猪流行性腹泻病毒荧光定量检测试纸条及其制备方法和应用
摘要：	本发明公开了猪流行性腹泻病毒荧光定量检测试纸条及其制备方法和应用。所述的荧光定量检测试纸条按照连接顺序依次包括样品垫、喷有荧光标记物探针的荧光标记物结合垫、喷涂有检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜以及吸水纸，还包括位于下方的塑料底衬、其中塑料底衬的作用是提供组装平台，其中，荧光标记物结合垫上喷涂有PEDV单抗荧光微球标记物和兔IgG荧光微球标记物，所述的硝酸纤维素膜上喷涂有PEDV单抗形成的检测线T以及羊抗兔IgG多抗形成的质控线C。实验证明，本发明的试纸条敏感性比现有的RT‑PCR和胶体金试纸条检测方法至少提高10倍，而且对检测样本进行了初步定量，并将检测结果数字化，避免了人的主观性偏差，为早期确诊PEDV提供了技术手段。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	黑龙江;23
申请人：	中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
发明人：	冯力;刘建波;时洪艳;肖理文
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-28T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-30T00:00:00+0800
申请号：	CN201910452755.8
公开号：	CN110187097A
代理机构：	北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司
代理人：	孙皓晨;马鑫
分类号：	G01N33/533(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	150001 黑龙江省哈尔滨市南岗区马端街427号
主权项：	1.一种猪流行性腹泻病毒(PEDV)荧光定量检测试纸条，其特征在于，所述的荧光定量检测试纸条按照连接顺序依次包括样品垫、喷有荧光标记物探针的荧光标记物结合垫、喷涂有检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜以及吸水纸，还包括位于下方的塑料底衬、其中塑料底衬的作用是提供组装平台，其中，荧光标记物结合垫上喷涂有PEDV单抗荧光微球标记物和兔IgG荧光微球标记物，所述的硝酸纤维素膜上喷涂有PEDV单抗形成的检测线T以及羊抗兔IgG多抗形成的质控线C；其中，用于制备PEDV单抗荧光微球标记物的PEDV单抗，命名为15B12，由保藏编号为CGMCC NO.16299的杂交瘤细胞分泌产生；其中，用于喷涂检测线T的PEDV单抗，命名为4H7，由保藏编号为CGMCC NO.16300的杂交瘤细胞分泌产生。 2.如权利要求1所述的荧光定量检测试纸条，其特征在于，所述的样品垫通过以下方法制备得到：用含有10mmol/L EDTA、1％(v/v)的Tween-20、0.5％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、0.5％(w/v)的牛血清白蛋白(BSA)的0.2mol/L，pH8.0的磷酸缓冲液(PBS)浸泡样品垫，然后置于37℃烘箱中烘烤2h至完全干燥，即得。 3.如权利要求1所述的荧光定量检测试纸条，其特征在于，喷有荧光标记物探针的荧光标记物结合垫通过以下方法制备得到：用含2.5％(w/v)海藻糖、1％(w/v)BSA、1％(v/v)Tween-20、0.5％(w/v)的PVP的0.1mol/L pH7.4的PBS浸泡荧光标记物结合垫，然后置于37℃烘箱中烘干2h，再将PEDV单抗荧光微球标记物和兔IgG荧光微球标记物分别用0.1mol/LpH7.4的PBS稀释600倍和800倍后，喷于处理烘干后的荧光标记物结合垫，置于37℃烘箱中烘干2h后，置于密封干燥包装袋中保存备用。 4.如权利要求1或3所述的荧光定量检测试纸条，其特征在于，所述的PEDV单抗荧光微球标记物和兔IgG荧光微球标记物是以铕(Eu)元素为发光元素的荧光微球对抗体进行标记。 5.如权利要求4所述的荧光定量检测试纸条，其特征在于，所述的PEDV单抗荧光微球标记物通过以下方法制备得到：取固体含量为1％的Eu荧光微球100μL稀释于400μL 0.05mol/L pH8.0的硼酸缓冲液中，加入30μL 10mg/mL的碳二亚胺(EDC)和60μL 10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温置于旋转摇床上50转/min活化15min，然后40000g离心10min，去除上清溶液，用0.05mol/LpH8.0的硼酸缓冲液复溶，然后80W超声处理30s，加入50μg的PEDV单抗15B12，室温置于旋转摇床上50转/min偶联2小时，加入含有50mmol/L的乙醇胺的10％(w/v)的BSA溶液50μL封闭过夜，最后40000g离心10min，用0.05mol/L pH8.0的硼酸缓冲液复溶，反复洗涤2～3次，然后80W超声处理30s，置于4～8℃冰箱中保存备用。 6.如权利要求4所述的荧光定量检测试纸条，其特征在于，所述的兔IgG荧光微球标记物通过以下方法制备得到：取固体含量为1％的Eu荧光微球100μL稀释于400μL 0.05mol/L pH8.0的硼酸缓冲液中，加入30μL 10mg/mL的碳二亚胺(EDC)，再加入100μg兔IgG，室温置于旋转摇床上50转/min偶联2h，加入含有50mmol/L的乙醇胺的10％w/v的BSA溶液50μL封闭过夜，最后40000g离心10min，用0.05mol/L pH8.0的硼酸缓冲液复溶，反复洗涤2～3次，然后80W超声处理30s，置于4～8℃冰箱中保存备用。 7.如权利要求1所述的荧光定量检测试纸条，其特征在于，所述的喷涂有检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜通过以下方法制备得到：将PEDV单抗4H7用含1.5％(w/v)海藻糖、0.5％(w/v)BSA、0.05％(v/v)十二烷基磺酸钠(SDS)的0.01mol/L pH7.4的磷酸缓冲溶解至终浓度0.025mg/mL，用喷膜机喷涂在硝酸纤维素膜上形成检测线T；将羊抗兔IgG多抗用含1.5％(w/v)海藻糖、0.5％(w/v)BSA、0.05％(v/v)SDS的0.01mol/L pH7.4的PBS溶解至终浓度1.0mg/mL，用喷膜机喷涂在硝酸纤维素膜上形成质控线C，将喷涂好的硝酸纤维素膜37℃烘干2h，置于室温干燥环境中保存备用。 8.权利要求1-7任一项所述的荧光定量检测试纸条在制备检测猪流行性腹泻病毒试剂中的应用。
所属类别：	发明专利