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原文传递一种快速检测猪流行性腹泻病毒的方法

专利名称：	一种快速检测猪流行性腹泻病毒的方法
摘要：	本发明涉及到一种快速检测猪流行性腹泻病毒的方法，本发明的一种快速检测猪流行性腹泻病毒的方法，采用在Vero传代细胞生长的PEDV—G1株，所述的Vero传代细胞的制备为：Vero细胞长成单层后，弃去营养液，加入病毒液，室温感作1.5h；然后加入维持液，放到37.5℃培养；病毒在细胞生长60h有明显病变时收取毒液，冻融，离心去细胞碎片，置‑70℃以下冻存，所述的检测方法为，取猪肠粘膜深层压片，经丙酮固定后，荧光染色，检测PEDV—G1株。本发明提供的检测方法具备高效准确的特点。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	四川;51
申请人：	绵阳师范学院
发明人：	廖晨晨;龙洁;郑姚;陈希文;熊玲;尹丹
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-07T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-23T00:00:00+0800
申请号：	CN201910373799.1
公开号：	CN110045118A
代理机构：	北京天盾知识产权代理有限公司
代理人：	葛宏
分类号：	G01N33/569(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	621000 四川省绵阳市游仙区仙人路1段30号
主权项：	1.一种快速检测猪流行性腹泻病毒的方法，其特征在于，检测猪流行性腹泻病毒采用在Vero传代细胞生长的PEDV—G1株。 2.如权利要求1所述的一种快速检测猪流行性腹泻病毒的方法，其特征在于，所述的Vero传代细胞的制备为：Vero细胞长成单层后，弃去营养液，加入病毒液，室温感作1.5h；然后加入维持液，放到37.5℃培养；病毒在细胞生长60h有明显病变时收取毒液，冻融，离心去细胞碎片，置-70℃以下冻存。 3.如权利要求1所述的一种快速检测猪流行性腹泻病毒的方法，其特征在于，所述的检测方法为，取猪肠粘膜深层压片，经丙酮固定后，荧光染色，检测PEDV—G1株。 4.如权利要求3所述的一种快速检测猪流行性腹泻病毒的方法，其特征在于，所述的荧光染色具体过程为： (1)、球蛋白的分离和提纯将兔PED高免血清20ml放于三角瓶中，再将三角瓶放入装有冰块的大烧杯中，滴加等体积的饱和硫酸铵溶液，搅拌5min，出现蛋白质沉淀时，放于冰箱中2h，然后离心，倒去上清液；用生理盐水溶解沉淀，再加入等体积的01005M、含011MNaCI的PBS； (2)、球蛋白的脱盐用葡聚糖凝胶G50(SepHadexG50)分离盐离子，提取球蛋白；称取等量的葡聚糖，经用PBS冲洗去漂浮粒子及充分膨胀后，装入到层析管中；将含有硫酸盐离子的球蛋白用滴管加在葡聚糖柱上，缓慢加入；将过柱速度控制为1ml/min，收集50滴为一个样品；收集到的球蛋白，用1％氯化钡检测硫酸根离子，用纳氏试剂检测铵离子，当证实不含有硫酸根离子和铵离子时，将球蛋白放冰箱备用； (3)、球蛋白与异硫氰酸荧光黄(FITC)的结合 FITC与球蛋白的比例为1：20～1：40；将FITC用pH9.0～pH9.5、0.025M碳酸盐缓冲液配成1mg/ml；再将球蛋白浓缩；盛于置有小磁棒的瓶内，置冰箱内，边搅拌边滴加等量的ITC；加完后用橡皮塞塞紧瓶口，4℃搅拌结合8h；用葡聚糖G50除去游离FITC；收集荧光抗体，调定蛋白浓度为12mg/ml时冻干备用； (4)、荧光抗体的浓缩：蛋白质浓度的调定是用葡聚糖G50吸水法，于蛋白溶夜中加入适量的葡聚糖，待其吸收水分后，用离心法除去凝胶即成； (5)、荧光抗体的冻干：冻干机室的温度25℃；冻干时间2.5h。 5.如权利要求4所述的一种快速检测猪流行性腹泻病毒的方法，其特征在于，荧光抗体的特异性测定，将用清洁液处理过的盖玻片放入16孔板上的各孔中，加入PK15细胞，再加入猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪细小病毒(PPV)、轮状病毒(RV)和大肠杆菌。 6.如权利要求4所述的一种快速检测猪流行性腹泻病毒的方法，其特征在于，所述的TGEV取自美国农业部，PPV、RV取自江苏兽医研究所，大肠杆菌取自军事医学研究所；37℃培养48h见CPE后，经丙酮固定，同样方法进行PED荧光染色，在荧光显微镜下观察反应。
所属类别：	发明专利