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原文传递一种基于拟多级谱进行完整糖基化肽段的质谱检测方法

专利名称：	一种基于拟多级谱进行完整糖基化肽段的质谱检测方法
摘要：	本发明涉及一种基于拟多级谱进行完整糖基化肽段的质谱检测方法，及其在肝癌的早期诊断中的应用。该发明主要包括以下五个步骤：1)糖基化肽段的富集；2)去糖基化肽段‑完整糖基化肽段的样品制备；3)去糖基化肽段‑完整糖基化肽段的质谱检测；4)去糖基化肽段‑完整糖基化肽段的谱图数据检索；5)在此基础上，结合糖基化位点、完整糖肽定量技术，实现肿瘤患者与正常人的糖基化精细差异分析，筛选潜在的疾病标记物。本方法实现了人源蛋白质糖基化的精细解析，在肿瘤标志物的筛选方面具有重要的应用潜力。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	辽宁;21
申请人：	中国科学院大连化学物理研究所
发明人：	叶明亮;秦洪强;陈尧;王璐
专利状态：	有效
申请日期：	2017-12-14T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-02T00:00:00+0800
申请号：	CN201711339389.2
公开号：	CN109959699A
代理机构：	沈阳科苑专利商标代理有限公司
代理人：	马驰
分类号：	G01N27/62(2006.01);G;G01;G01N;G01N27
申请人地址：	116023 辽宁省大连市中山路457号
主权项：	1.一种基于拟多级谱进行完整糖基化肽段的质谱检测方法，其特征在于： (1)去糖基化肽段-完整糖基化肽段的样品制备，利用亲水作用色谱富集蛋白样品酶解物中的糖基化肽段，将富集的糖基化肽段分作两份，取其中一份采用糖苷酶进行糖基化肽段的糖链简化处理，并将糖苷酶处理的去糖基化肽段与糖基化肽段混合，进行二者的同时检测； (2)去糖基化肽段-完整糖基化肽段的同时质谱检测，主要是利用质谱的不同碎裂能量(包含并不局限于台阶能量碎裂模式)，实现去糖基化肽段-完整糖基化肽段的同时高效碎裂； (3)去糖基化肽段-完整糖基化肽段的谱图数据检索，利用完整糖肽碎裂产生的特征碎裂，进行糖链结构的确认，并结合相应的去糖基化肽段，确认完整糖肽的肽段骨架序列信息和糖链结构。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中， 1)取人源细胞或组织样品，进行蛋白质样品的提取和酶解，以及糖基化肽段富集； 2)步骤1)结束后得到的样品，按比例分成两份，其中一份使用糖苷酶进行去糖基化处理，并将两份样品重新混合，待进行后续样品富集。 3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中， 1)将步骤(1)收集的去糖基化肽段-完整糖基化肽段混合样品复溶，同时在一次液相色谱进行分离，有效降低二者保留时间的差异； 2)在步骤1)实现了去糖基化肽段-完整糖基化肽段同时分离的基础上，利用不同的质谱碎裂模式(包含并不局限于台阶能量碎裂模式)，进行二者的同时碎裂，获得相应的碎裂谱图库。 4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中， 1)将步骤(2)采集的质谱经过收集其中的糖碎片鎓离子(204.0875Da等)，确认相应的完整糖肽碎裂谱图，并进行收集，根据N-糖的五核心结构确定其中的肽段骨架序列分子量，并获得相应糖链的分子量； 2)将步骤1)剩余的谱图进行去糖基化肽段的直接检索，获得相应肽段的序列骨架信息； 3)将步骤1)与2)获得的糖链信息、完整糖肽的肽段分子量与去糖基化肽段进行匹配，并利用保留时间、精确分子量等特征进行控制假阳性率，获得完整糖基化肽段的结构信息。 5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：该方法能同时获取相应的糖基化蛋白质、糖基化肽段和糖基化位点的鉴定结果，可以用于糖基化修饰的蛋白质组学分析。 6.根据权利要求1、2、3或4所述的方法，其特征在于：利用权利要求1、2、3或4所述的方法，分别对肿瘤患者和正常人的血清、组织样品进行分析，结合糖基化位点占有率差异、完整糖基化肽段的定量差异，实现肿瘤患者与正常人的糖基化精细差异分析，可筛选潜在的疾病标记物。 7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：进行肿瘤患者和正常人收集血清、组织中N-连接位点占有率、位点特异性糖肽的分析，实现其糖基化精细结构差异分析，获得相应的差异糖基化肽段，用于提高临床诊断准确度和预后的效果评价，可在肝癌、肺癌等恶性肿瘤的早期诊断中的应用。
所属类别：	发明专利