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原文传递一种体液样本中细胞PD-L1蛋白表达的检测方法及其专用试剂

专利名称：	一种体液样本中细胞PD-L1蛋白表达的检测方法及其专用试剂
摘要：	本发明公开了一种体液样本中细胞PD‑L1蛋白表达的检测方法及其专用试剂，特点是包括以下步骤：将制备的免疫磁微粒混合液与体液样本中肿瘤循环细胞结合，然后置于免疫磁微粒捕获仪中进行捕获，将捕获的肿瘤细胞通过PD‑L1免疫组化染色试剂进行染色，评估PD‑L1的蛋白表达，其中免疫磁微粒混合液为包被抗人EpCAM免疫磁微粒、抗人ICAM‑1免疫磁微粒、抗人EGFR抗体免疫磁微粒、抗人叶酸受体免疫磁微粒、抗人CD10免疫磁微粒、抗人CD19免疫磁微粒、抗人CD20免疫磁微粒和抗人CD33免疫磁微粒中的至少一种，优点是具有操作简单、灵敏度高和检测结果易判读。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	宁波美晶医疗技术有限公司
发明人：	张晓晶;沈挺;宋毅
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-04T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-05T00:00:00+0800
申请号：	CN201910159426.4
公开号：	CN109975554A
代理机构：	宁波奥圣专利代理事务所(普通合伙)
代理人：	何仲
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	315100 浙江省宁波市高新区光华路299弄6幢12号1-1
主权项：	1.一种体液样本中细胞PD-L1蛋白表达的检测方法，其特征在于包括以下步骤：将制备的免疫磁微粒混合液与体液样本中肿瘤循环细胞结合，然后置于免疫磁微粒捕获仪中进行捕获，将捕获的肿瘤细胞通过PD-L1免疫组化染色试剂进行染色，评估PD-L1的蛋白表达。 2.根据权利要求1所述的一种体液样本中细胞PD-L1蛋白表达的检测方法，其特征在于：所述的免疫磁微粒混合液为包被抗人EpCAM免疫磁微粒、抗人ICAM-1免疫磁微粒、抗人EGFR抗体免疫磁微粒、抗人叶酸受体免疫磁微粒、抗人CD10免疫磁微粒、抗人CD19免疫磁微粒、抗人CD20免疫磁微粒和抗人CD33免疫磁微粒中的至少一种。 3.根据权利要求2所述的一种体液样本中细胞PD-L1蛋白表达的检测方法，其特征在于所述的免疫磁微粒的制备方法具体步骤如下：（1）磁微粒的预处理：在含有磁微粒的离心管中加入0.05mol/L MES缓冲液，将离心管置于磁力架上静置分层后，吸弃上清，向离心管中加入等量的 0.05mol/L MES缓冲液，进行超声处理后，置于磁力架上静置分层后，吸弃上清，重复上述步骤2-4次；在离心管中再次加入0.5mL 0.05mol/L MES缓冲液，继续在超声仪中进行超声处理，得到大小一致、形状完整以及分布均匀的磁微粒悬浮液；其中MES缓冲液一次添加量为每2mg磁微粒添加1mL MES缓冲液；磁微粒为粒径200-1000nm的棕色圆形或椭圆形磁微粒，羧基含量为200μmol/g-600μmol/g；（2）磁微粒活化：在磁微粒悬浮液中分别加入50mg/mL NHS溶液活化剂和50mg/mL EDAC溶液活化剂，然后置于可调式旋转混合器上，于25~40rpm、37±2℃反应30min后，加入HEPS缓冲液进行润洗，置于磁力架上重复洗涤2-4次，吸弃上清得到活化后磁微粒；其中NHS溶液、EDAC溶液和HEPS缓冲液的添加量为每2mg磁微粒添加100μLNHS溶液、100μLEDAC溶液和1mL HEPS缓冲液；（3）磁微粒偶联抗体：在含有活化后磁微粒的离心管中加入抗体密封后，放入垂直旋转混合器上，于37±2℃，25~30rpm转速混匀10-14小时，得到包被了抗体的免疫磁微粒；其中抗体添加量为每2mg磁微粒添加10μg抗体，所述的抗体为抗人EpCAM抗体、抗人ICAM-1抗体、抗人EGFR抗体、抗人叶酸受体抗体、抗人CD10抗体、抗人CD19抗体、抗人CD20抗体或者抗人CD33抗体。 4.根据权利要求3所述的一种体液样本中细胞PD-L1蛋白表达的检测方法，其特征在于：在含有包被了抗体的免疫磁微粒的离心管中迅速加入75mg/mL的封闭剂和100mg/mL的BSA溶液，在漩涡混合器上混匀后，将离心管放入垂直旋转混合器上，于37±2℃，25~30rpm转速封闭2小时；将离心管取下，加入清洗液进行重悬，磁力架上静置分层后吸弃上清，用清洗液重复洗涤2-4次后，加入保存液进行重悬，磁力架上静置分层后吸弃上清，用保存液重复洗涤2次，最后用保存液重悬免疫磁微粒，得到无团聚的免疫磁微粒溶液；其中各成分单次添加量为每2mg磁微粒添加200μL封闭剂、200μLBSA溶液、1mL清洗液和1mL保存液，所述的封闭剂为75mg/mL的甘氨酸水溶液，所述的清洗液为含0.1%曲拉通和0.53%吐温20的0.9wt%氯化钠溶液，所述的保存液为含1.6wt%BSA的HEPS液。 5.根据权利要求1所述的一种体液样本中细胞PD-L1蛋白表达的检测方法，其特征在于：所述的免疫磁微粒捕获仪为免疫磁微粒捕获仪CellRichTM，设置程序为：样本量为1.0-7.5mL，捕获速度为1.0-5.0mL/h，冲洗速度为2.0-7.0mL/h。 6.根据权利要求1所述的一种体液样本中细胞PD-L1蛋白表达的检测方法，其特征在于：所述的PD-L1免疫组化染色试剂的一抗为型号MAB1561或ab205921的抗人PD-L1抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG或辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG。 7.根据权利要求6所述的一种体液样本中细胞PD-L1蛋白表达的检测方法，其特征在于：所述PD-L1免疫组化染色试剂的一抗浓度为0.5mg/ml、二抗浓度为0.8mg/ml、封闭液为含有5vt%山羊血清的TBST缓冲液以及显色液为DAB显色剂。 8.一种用于权利要求1所述的体液样本中细胞PD-L1蛋白表达检测的专用试剂，其特征在于：所述的试剂包括免疫磁微粒混合液，所述的免疫磁微粒混合液为包被抗人EpCAM免疫磁微粒、抗人ICAM-1免疫磁微粒、抗人EGFR抗体免疫磁微粒、抗人叶酸受体免疫磁微粒、抗人CD10免疫磁微粒、抗人CD19免疫磁微粒、抗人CD20免疫磁微粒和抗人CD33免疫磁微粒中的至少一种。 9.一种权利要求8所述的用于体液样本中细胞PD-L1蛋白表达检测的专用试剂的应用，其特征在于：所述的免疫磁微粒混合液在制备肺癌患者CTCs捕获剂方面的应用，其中免疫磁微粒混合液中抗人EpCAM免疫磁微粒、抗人ICAM-1免疫磁微粒、抗人EGFR抗体免疫磁微粒和抗人叶酸受体免疫磁微粒的混合质量比为2：2：2：4；所述的免疫磁微粒混合液在制备肺癌患者肺癌胸腹水CTCs捕获剂方面的应用，其中免疫磁微粒混合液中抗人EpCAM免疫磁微粒、抗人ICAM-1免疫磁微粒、抗人EGFR抗体免疫磁微粒和抗人叶酸受体免疫磁微粒的混合质量比为4：4：1：1；所述的免疫磁微粒混合液在制备白血病幼稚细胞捕获剂方面的应用，其中免疫磁微粒混合液中抗人CD10免疫磁微粒、抗人CD19免疫磁微粒、抗人CD20免疫磁微粒和抗人CD33免疫磁微粒的混合质量比为1：1：4：4。 10.一种用于权利要求1所述的体液样本中细胞PD-L1蛋白表达检测的专用试剂，其特征在于：所述的试剂包括PD-L1免疫组化染色试剂，所述的PD-L1免疫组化染色试剂的一抗为型号MAB1561或ab205921的抗人PD-L1抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG或辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG。
所属类别：	发明专利