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原文传递基于SPR技术的烟碱类杀虫剂噻虫啉残留检测方法

专利名称：	基于SPR技术的烟碱类杀虫剂噻虫啉残留检测方法
摘要：	本发明公开了一种用于检测新烟碱类杀虫剂噻虫啉残留的SPR免疫传感检测方法。本发明以抗原抗体免疫反应为基本原理，将抗体作为传感器敏感识别元件，利用直接竞争法快速、方便结合SPR技术对杀虫剂噻虫啉进行残留检测，通过化学键将噻虫啉单克隆抗体固定在SPR芯片表面，与待测液中的噻虫啉小分子结合引起信号，提高其检测灵敏度，改善检测方位，建立信号放大的间接竞争抑制法。方法的最低检出限为0.197ng/mL，IC50为2.13ng/mL,检测范围在1.18‑2.81ng/mL之间，使得检测更灵敏。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	浙江大学
发明人：	程敬丽;郭逸蓉;杨勇;李中珊;焦莎莎;朱国念
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-18T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-09T00:00:00+0800
申请号：	CN201910202191.2
公开号：	CN109991419A
代理机构：	杭州中成专利事务所有限公司
代理人：	金祺
分类号：	G01N33/577(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘路866号
主权项：	1.基于SPR技术的烟碱类杀虫剂噻虫啉残留检测方法，其特征在于包括以下步骤：步骤(1)：将SPR芯片作为传感芯片；步骤(2)：校正流通通道、用缓冲液洗涤SPR芯片；步骤(3)：往SPR芯片表面通入200～400μL的EDC/NHS混合液，流速为10～30μL/min，从而活化SPR芯片表面的羧基基团；所述EDC/NHS混合液中，EDC浓度为(0.4±0.04)M，NHS浓度为(0.1±0.01)M；以水为溶剂；步骤(4)：在步骤(3)所得的活化表面羧基后的SPR芯片上流入0.5～2.0μL/min噻虫啉单克隆抗体稀释液，使其偶联到活化过的羧基上，直至SPR芯片饱和；噻虫啉单克隆抗体稀释液为：用pH4.0～5.5的乙酸钠缓冲溶液稀释噻虫啉单克隆抗体至浓度为20±5μg/ml，得噻虫啉单克隆抗体稀释液；步骤(5)：在步骤(4)所得的噻虫啉抗体偶联后的SPR芯片上以10～30μL/min的流速通入70～100μL乙醇胺盐酸盐溶液，用以封闭未反应的活化过的羧基位点；步骤(6)：用PBS-P+缓冲液将噻虫啉原药稀释成系列浓度的噻虫啉溶液，10～30μL.min-1进样(120±20)s，再将(10±2)mM NaOH以10～30μL.min-1的流速流过芯片表面，使得再生后的RU值与结合噻虫啉溶液前的RU值相同，然后根据结合反应前后RU变化值与噻虫啉浓度来建立标准曲线；步骤(7)：取30-50μL待测样品，以10～30μL.min-1的流速通入SPR芯片，再将(10±2)mMNaOH以10～30μL.min-1的流速流过芯片表面，使得再生后的RU值与结合噻虫啉溶液前的RU值相同，并根据结合反应前后RU变化值与噻虫啉浓度来建立标准曲线，获得待测样品中噻虫啉的含量。 2.根据权利要求1所述的基于SPR技术的烟碱类杀虫剂噻虫啉残留检测方法，其特征在于：所述步骤(6)中，系列浓度的噻虫啉溶液为0.78125,1.56,3.125,6.25,12.5nM。 3.根据权利要求1或2所述的基于SPR技术的烟碱类杀虫剂噻虫啉残留检测方法，其特征在于：所述步骤(6)所得的标准曲线方程为y＝33.33-32.28/(1+(x/8.42)2.36)。 4.根据权利要求1～3任一所述的基于SPR技术的烟碱类杀虫剂噻虫啉残留检测方法，其特征在于所述步骤(2)中：以体积浓度为(70±5)％的甘油水溶液校正流通通道；缓冲液为PBS-P+缓冲液，所述PBS-P+缓冲液由聚山梨酯表面活性剂P20和磷酸盐缓冲溶液混合而得；所述PBS-P+缓冲液中聚山梨酯表面活性剂P20的体积浓度为0.05％； PBS-P+缓冲液以(10±1)μL/min的流速洗涤芯片表面，洗涤时间为(200±20)s。 5.根据权利要求1～4任一所述的基于SPR技术的烟碱类杀虫剂噻虫啉残留检测方法，其特征在于：所述噻虫啉抗体为以SCL-BSA为免疫原制备的具有特异性识别的鼠源单克隆抗体。 6.根据权利要求5所述的基于SPR技术的烟碱类杀虫剂噻虫啉残留检测方法，其特征在于： SCL-BSA免疫原，是由噻虫啉半抗原SCL-hpten偶联牛血清蛋白BSA制备得到。 7.根据权利要求5或6所述的基于SPR技术的烟碱类杀虫剂噻虫啉残留检测方法，其特征在于SCL半抗原的制备方法为：噻虫啉、碳酸铯、巯基丙酸以1:0.2～2.0:0.2～2.0的摩尔比溶解于DMSO中，在20～100℃下搅拌反应8～10小时，反应液pH调至(2.0±0.2)，乙酸乙酯萃取，有机相经过无水Na2SO4干燥后减压浓缩得到粗品，经过硅胶柱纯化(EA:PE：HCOOH＝80:20:1)后得到SCL半抗原。 8.根据权利要求1～7任一所述的基于SPR技术的烟碱类杀虫剂噻虫啉残留检测方法，其特征在于：步骤(7)中的待测样品为植物样品、土壤样品、水样。
所属类别：	发明专利