详情

原文传递一种用于检测酪氨酸酶的三明治结构的SERS传感器及其制备和检测方法

专利名称：	一种用于检测酪氨酸酶的三明治结构的SERS传感器及其制备和检测方法
摘要：	本发明公开了一种用于检测酪氨酸酶的三明治结构的SERS传感器及其制备和检测方法，该SERS传感器利用酪氨酸酶抗原抗体的特异性识别的原理，通过磁性基底的吸附和表面增强拉曼探针的增强作用，基底上的固相抗体与标记抗体通过与抗原的结合形成“固相抗体—待测抗原—标记抗体”三明治结构，通过对标记分子SERS信号的识别进行分析酪氨酸酶的含量，据此建立了检测酪氨酸酶的表面增强拉曼分析方法。本发明所述的检测方法具有快速、灵敏，简便、样品消耗少等优点。此外，利用此传感器检测酪氨酸酶具有良好的的线性，检测限较低，可达1ng/mL。同时，实际人血清样品中酪氨酸酶的加标回收率在96.0%‑136.0%范围内。因此，本发明有望成为临床检测酪氨酸酶的一种有效方法。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	福建;35
申请人：	福建师范大学
发明人：	陆德婵;先丽;卢玉栋;翁婷炜;沈慧英;吴阳;朱兰瑾;陈玉婷
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-25T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-09T00:00:00+0800
申请号：	CN201910337215.5
公开号：	CN109991207A
代理机构：	福州科扬专利事务所
代理人：	李晓芬
分类号：	G01N21/65(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	350300 福建省福州市福清市龙江街道校园新村一号福建师范大学研发中心
主权项：	1.一种酪氨酸酶灵敏检测的三明治结构SERS传感器的制备方法，其特征在于，由下述方法制得： (1)Au4MB@Au胶体的制备取10mL纳米金溶胶，加入5-15μL浓度为0.1mol/L的4巯基苯甲腈的乙醇溶液作为拉曼信号分子，搅拌混合均匀后离心，洗去未吸附在纳米金溶胶上的4巯基苯甲腈的溶液，离心后的沉淀重新悬浮于10mL超纯水中，得Au@4MB胶体；往10mL的制备好的Au@4MB胶体中加入100-250μL浓度为610-2mol/L的柠檬酸钠溶液，磁力搅拌加热至沸腾后，加入2.5mL浓度为1mmol/L氯金酸溶液后停止加热，继续磁力搅拌1h后，将胶体离心洗涤2次，离心后的沉淀重新分散于5ml超纯水中，得到Au4MB@Au胶体,浓度约为0.2nmol/L (2)SERS探针的制备取1mL步骤(1)中制备好的Au4MB@Au胶体，加入5-40μL浓度为10-4mol/L的巯基-聚乙二醇-羧基溶液，搅拌后离心洗涤重新分散于1mLPBS缓冲溶液中，再加入50μL的浓度为10mg/mL1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺溶液和50μL浓度为10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺溶液用来活化胶体表面的羧基，搅拌30min后离心洗涤去除多余的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液，重分散于1mL PBS缓冲溶液中，得到Au4MB@Au-HS-PEG-COOH胶体；将20-70μL浓度为1.210-2mg/mL的酪氨酸酶抗体加入至1mLAu4MB@Au-HS-PEG-COOH胶体中，25℃偶联2h后加入5μL质量分数为5％的牛血清蛋白溶液，25℃反应1h从而封闭Au4MB@Au-HS-PEG-COOH胶体表面未反应的羧基基团，制得SERS探针； (3)磁性基底的制备取500μL浓度为0.5mg/mL的羧基化的磁珠加入50μL的浓度为10mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺溶液和50μL浓度为10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺溶液，旋涡混匀使磁珠充分悬浮，25℃活化30分钟，磁性分离洗涤，去除上清液；接着加入20-70μL的酪氨酸酶的抗体，25℃偶联1.5-3h后加入5μL质量浓度为5％的牛血清蛋白溶液，25℃反应1h封闭磁珠表面未反应的活化羧基基团，离心管置于磁性分离器上分离去除上清液，得磁性基底； (4)SERS传感器的制备取1mL制备好的SERS探针和500μL制备好的磁性基底放置于5毫升离心管中超声5min混合，即得SERS传感器。 2.根据权利要求1所述一种酪氨酸酶灵敏检测的三明治结构SERS传感器的制备方法，其特征在于，所述纳米金胶溶液由以下方法制得：取100mL质量分数为0.01％的氯金酸溶液在磁力搅拌下加热至沸腾；然后取1-2mL质量分数为1％柠檬酸钠溶液，加入沸腾的氯金酸溶液中，待沸腾10-20min反应结束，冷却至室温，制成纳米金溶胶。 3.根据权利要求1所述一种酪氨酸酶灵敏检测的三明治结构SERS传感器的制备方法，其特征在于：所述HS-PEG-COOH的分子量为2000。 4.根据权利要求1所述一种酪氨酸酶灵敏检测的三明治结构SERS传感器的制备方法，其特征在于：所述磁珠的粒径为1微米。 5.根据权利要求2所述一种酪氨酸酶灵敏检测的三明治结构SERS传感器的制备方法，其特征在于：所述纳米金溶胶的粒径为25-40nm,紫外吸收波长为520nm。 6.根据权利要求1所述一种酪氨酸酶灵敏检测的三明治结构SERS传感器的制备方法，其特征在于：所述Au4MB@Au核壳结构的粒径为35-50nm，紫外吸收波长为530nm。 7.应用一种如权利要求1-6任一项所述三明治结构SERS传感器的制备方法制备的SERS传感器检测酪氨酸酶的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)建立工作曲线：配置不同浓度的酪氨酸酶样品溶液；将SERS传感器与不同浓度的酪氨酸酶室温下共培养1h，磁分离去除上清液后，将沉淀取出滴于铝板上进行SERS检测；记录传感器SERS信号强度，以传感器SERS信号下降幅度为纵坐标，酪氨酸酶浓度为横坐标作出相对应的工作曲线； (2)将SERS传感器与待测样品共培养1h，磁分离去除上清液后，将沉淀取出滴于铝板上进行SERS检测，记录传感器SERS信号强度，计算SERS信号强度的下降幅度，对照工作曲线，计算得出血清中酪氨酸酶的浓度。 8.根据权利要求7所述的检测酪氨酸酶的方法，其特征在于：所述拉曼的激发波长为785nm。 9.根据权利要求7所述的检测酪氨酸酶的方法，其特征在于：所述SERS方法绘制的工作曲线方程为：Y＝38.06+24.8Log[X]，其中Y为4-巯基苯甲腈的拉曼强度；X为酪氨酸酶的浓度，最低检测限1ng/mL。
所属类别：	发明专利