详情

原文传递一种狂犬病毒抗体定量检测试剂盒及其制备方法与检测方法

专利名称：	一种狂犬病毒抗体定量检测试剂盒及其制备方法与检测方法
摘要：	本发明公开了一种狂犬病毒抗体定量检测试剂盒及其制备方法与检测方法，属于抗体检测试剂盒技术领域，解决现有技术抗体检测准确度不够高，存在安全隐患的问题。本发明的试剂盒包括免疫层析检测试纸条和样品稀释液，免疫层析检测试纸条由一端至另一端依次包括：包被狂犬病毒抗原的样品垫、包被抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体的标记垫、包被检测线和质控线的硝酸纤维素膜、以及吸水垫，其彼此相互重叠并贴于背板的上表面。本发明采用竞争法检测血中狂犬病毒抗体，同时配合读条设备，根据标准曲线可直接显示出血样中的真实抗体数值，提高检测的准确性和灵敏度。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	吉林;22
申请人：	长春西诺生物科技有限公司
发明人：	刘伟;王倩;石晶;殷玉和;夏振强;王慧慧;崔玉梅;丁秋雨;赵玉环;刘洪运
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-12T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-12T00:00:00+0800
申请号：	CN201910291423.6
公开号：	CN110007080A
代理机构：	长春众邦菁华知识产权代理有限公司
代理人：	刘微
分类号：	G01N33/569(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	130000 吉林省长春市高新开发区普天路58号
主权项：	1.一种狂犬病毒抗体定量检测试剂盒，其特征在于，包括免疫层析检测试纸条和样品稀释液；所述免疫层析检测试纸条由一端至另一端依次包括：包被狂犬病毒抗原的样品垫、包被抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体的标记垫、包被检测线和质控线的硝酸纤维素膜、以及吸水垫，其彼此相互重叠并贴于背板的上表面；其中，样品垫包被的狂犬病毒抗原为狂犬病毒样颗粒，检测线包被有抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体，质控线包被有金黄色葡萄球菌A蛋白，标记垫包被的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体由胶体金或荧光微球标记；样品稀释液为含有10-20mmol/L硼砂，0.2-6％NaCl，0.1-0.5％Tween-20，0.1-0.5％NaN3，pH值为8.2-8.6的溶液。 2.如权利要求1所述的狂犬病毒抗体定量检测试剂盒，其特征在于，样品垫包被的狂犬病毒抗原的蛋白浓度为0.5-2.0g/L。 3.如权利要求1所述的狂犬病毒抗体定量检测试剂盒，其特征在于，金标垫包被的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体的蛋白浓度为50μg/ml。 4.如权利要求1所述的狂犬病毒抗体定量检测试剂盒，其特征在于，荧光垫包被的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体的蛋白浓度为0.01mg-0.05mg/ml。 5.如权利要求1所述的狂犬病毒抗体定量检测试剂盒，其特征在于，检测线包被的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体的蛋白浓度为1.0-2.0g/L。 6.如权利要求1所述的狂犬病毒抗体定量检测试剂盒，其特征在于，质控线包被的金黄色葡萄球菌A蛋白的蛋白浓度为1.0-2.0g/L。 7.如权利要求1-6任一项所述的狂犬病毒抗体定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： S1、样品垫制备：制备和纯化狂犬病毒抗原，将纯化后的狂犬病毒抗原用内含2％的Tween-20的20mM四硼酸钠溶液稀释成0.5-2.0mg/ml，喷涂于玻璃纤维素膜上，作为样品垫； S2、标记垫制备：将固含量为1％的微球悬浮液采用超声分散均匀，用超纯水10倍稀释；按照体积比1:25分别加入浓度为50mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺溶液和浓度为50mg/ml1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液，混匀，常温下反应0.5小时；将反应后的悬浮液分散均匀，按照蛋白浓度0.01mg-0.05mg/ml加入抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体，反应1-2min后，再超声20-40秒，然后再反应1小时；加至BSA终浓度为0.50％，进行封闭1-2小时；以10000r/min离心15-20min，溶于含1％牛血清、4％蔗糖、0.5％酪蛋白、pH6.0的0.01M硼酸缓冲液，喷涂在玻璃纤维上，作为标记垫； S3、硝酸纤维素膜包被：检测线包被的为1.0-2.0g/L的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体，包被液为含3％蔗糖的PBS，pH7.2；质控线包被的为1.0-2.0g/L的SPA，包被液为含3％蔗糖的PBS，pH7.2； S4、试纸组装：采用样品单向层析组装方式，在背板上的一端至另一端依次粘贴样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，组装后切条、密封，4-30℃保存。 8.如权利要求1-6任一项所述的狂犬病毒抗体定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： S1、样品垫制备：制备和纯化狂犬病毒抗原，将纯化后的狂犬病毒抗原用内含2％的Tween-20的20mM四硼酸钠溶液稀释成0.5-2.0mg/ml，喷涂于玻璃纤维素膜上，作为样品垫； S2、标记垫制备：用0.2mol/L K2CO3将25-40nm的胶体金溶液调节pH值为8.4后，将抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体按照蛋白浓度为50μg/ml，加入胶体金溶液中并继续搅拌30分钟；加入10％BSA至终浓度为1％，搅拌30分钟，以10000r/min离心30分钟，吸去上清液，沉淀物即为初步纯化的胶体金标记的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体，溶于含3％BSA、3％蔗糖、0.2％Tween-20和0.1％NaN3的20mmol/L Tris-HCl溶液，喷涂在玻璃纤维上，作为标记垫； S3、硝酸纤维素膜包被：检测线包被的为1.0-2.0g/L的抗狂犬病毒抗原的单克隆抗体，包被液为含3％蔗糖的PBS，pH7.2；质控线包被的为1.0-2.0g/L的SPA，包被液为含3％蔗糖的PBS，pH7.2； S4、试纸组装：采用样品单向层析组装方式，在背板上的一端至另一端依次粘贴样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，组装后切条、密封，4-30℃保存。 9.如权利要求1-6任一项所述的狂犬病毒抗体定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)标准曲线制作：用效价为0.125IU、0.25IU、0.5IU、1.0IU、2IU和4IU标准阳性血清经检测后，通过函数关系式y＝(ab+cxd)/(b+xd)进行四参数拟合，确定检测标准曲线，其中y代表反应值，x代表浓度，a代表曲线上渐近线估值，b代表曲线的斜率，c代表最大结合一半时对应的剂量，d代表曲线下渐近线估值； (2)将待检全血或血清样本与样品稀释液按1:50～1:100v/v混匀，即如果待检样本为全血，取20μL待测样本溶于1ml样品稀释液中，充分混匀；如待测样本为血清，取10μL待测样本溶于1ml样品稀释液中，充分混匀，即为待检样品处理液； (3)取待检样品处理液50～100μL加入样品垫上，室温静置10-20分钟内判定结果，结果判断方法为： (3)取待检样品处理液50～100μL加入样品垫上，室温静置10-20分钟内判定结果，结果判断方法为：狂犬病病毒抗体阳性：将试纸条放入配套的荧光检测仪器中，质控线处，出现一条绿色荧光条带，通过标准曲线比对，读取具体数值，计算T/C线的比值，数值≥0.5IU/ml；狂犬病病毒抗体阴性：将试纸条放入配套的荧光检测仪器中，在检测线和质控线处，各出现一条绿色荧光条带，通过标准曲线比对，读取具体数值，计算T/C线的比值，数值＜0.5IU/ml；无效：仅在检测线显色，而质控线无明显条带出现，视为试纸条检测无效。 10.如权利要求1-6任一项所述的狂犬病毒抗体定量检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)标准曲线制作：用效价为0.125IU、0.25IU、0.5IU、1.0IU、2IU和4IU标准阳性血清经检测后，通过函数关系式为y＝axb进行回归拟合，确定检测标准曲线，其中y代表OD值，x代表浓度，a代表截距，b代表回归系数； (2)将待检全血或血清样本与样品稀释液按1:50～1:100v/v混匀，即如果待检样本为全血，取20μL待测样本溶于1ml样品稀释液中，充分混匀；如待测样本为血清，取10μL待测样本溶于1ml样品稀释液中，充分混匀，即为待检样品处理液； (3)取待检样品处理液50～100μL加入样品垫上，室温静置10-20分钟内判定结果，结果判断方法为：狂犬病病毒抗体阳性：质控线处，出现一条红色条带；将试纸条放入配套的胶体金读条设备中，通过标准曲线比对，读取具体数值，计算T/C线的比值，数值≥0.5IU/ml；狂犬病病毒抗体阴性：在检测线和质控线处，各出现一条紫红色条带；将试纸条放入配套的胶体金读条设备中，通过标准曲线比对，读取具体数值，计算T/C线的比值，数值＜0.5IU/ml；无效：仅在检测线显色，而质控线无明显条带出现，视为试纸条检测无效。
所属类别：	发明专利