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原文传递用于检测狂犬病毒抗体的抗原蛋白的制备方法及试剂盒

专利名称：	用于检测狂犬病毒抗体的抗原蛋白的制备方法及试剂盒
摘要：	本发明涉体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种用于检测狂犬病毒抗体的抗原蛋白的制备方法及试剂盒，本发明含狂犬病毒G蛋白表达框的重组杆状病毒感染昆虫细胞，得到感染的昆虫细胞；将感染后的昆虫细胞培养进行培养增殖；由昆虫细胞中提取狂犬病毒抗体的抗原蛋白，并用抗原蛋白制作了试剂盒，解决了用传统方法狂犬病毒全病毒颗粒作为包被抗原，抗体检测结果中因含有中和抗体和非中和抗体，不能准确反映体内有效保护性抗体真实水平的问题，本发明可规模化生产，检测其它传染病阳性血清，无交叉反应，特异性强，灵敏度高，重复性好，线性范围宽，避免了生物安全风险，具有很强的创造性。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	湖北;42
申请人：	武汉生命科技股份有限公司
发明人：	华俊清;曾强;黄晶;王诺;项雅丽;吴边
专利状态：	有效
申请日期：	2018-12-18T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-31T00:00:00+0800
申请号：	CN201811549633.2
公开号：	CN109828109A
代理机构：	北京众合诚成知识产权代理有限公司
代理人：	刘江炀
分类号：	G01N33/569(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	430075 湖北省武汉市高新大道666号光谷生物城B6栋
主权项：	1.一种用于检测狂犬病毒抗体的抗原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： S1：将重组杆状病毒感染昆虫细胞； S2：将感染后的昆虫细胞进行培养增殖； S3：由培养增殖后的昆虫细胞中提取狂犬病毒抗体的抗原蛋白。 2.根据权利要求1所述的用于检测狂犬病毒抗体的抗原蛋白的制备方法，其特征在于，所述S1中，将含有狂犬病毒中和抗体结合位点的G蛋白基因片段克隆至杆状病毒表达载体并感染昆虫细胞，所述昆虫细胞为Sf9细胞。 3.根据权利要求2所述的用于检测狂犬病毒抗体的抗原蛋白的制备方法，其特征在于，所述含有狂犬病毒中和抗体结合位点的G蛋白基因片段的DNA编码序列为SEQ ID NO:1序列。 4.根据权利要求2所述的用于检测狂犬病毒抗体的抗原蛋白的制备方法，其特征在于，所述S1包括以下步骤： S11：将Sf9细胞经克氏瓶静置培养复苏； S12：对复苏后的Sf9细胞进行传代培养，传代后初始密度不低于2.5×105个/mL的接种量并逐步放大接种量至摇瓶培养； S13：当Sf9细胞生长密度达到2.0×106个/mL以上时，用携带G蛋白表达框的杆状病毒表达载体感染所述Sf9细胞。 5.根据权利要求1所述的用于检测狂犬病毒抗体的抗原蛋白的制备方法，其特征在于，其特征在于，S2中，所述感染后的昆虫细胞培养96-108h，至80％以上的昆虫细胞出现明显病变。 6.根据权利要求1所述的用于检测狂犬病毒抗体的抗原蛋白的制备方法，其特征在于，所述S3中，包括以下步骤： S31将病变的昆虫细胞800g离心5min沉淀收集昆虫细胞； S32使用100mL含20mmol咪唑的磷酸盐缓冲液重悬昆虫细胞，高压匀浆破碎昆虫细胞； S33将S32中的昆虫细胞12000g离心20min，弃沉淀，昆虫细胞破碎离心后的上清和昆虫细胞培养物上清经0.45μm滤膜过滤； S34将过滤后的细胞裂解液上清和培养物上清过柱，再次平衡层析柱； S35用含200mmol咪唑的磷酸盐缓冲液洗脱过柱后的昆虫细胞破碎离心后的上清和昆虫细胞培养物上清，在仪器显示UV值的波峰处提取并收集目的抗原蛋白，向所述抗原蛋白中加入终浓度为10％的甘油，调整抗原蛋白浓度为1mg/mL，并于-80℃对所述抗原蛋白进行贮存。 7.一种用于检测狂犬病毒抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒使用权利要求1至6中任一所述制备方法制备的抗原蛋白。 8.根据权利要求7所述的用于检测狂犬病毒抗体的试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：含有所述抗原蛋白的溶液，ELISA板，酶标记物，系列校准品，样品稀释液，浓缩洗涤液和显色试剂。 9.根据权利要求7所述的用于检测狂犬病毒抗体的试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：抗原蛋白包被的抗原包被板，酶标记物，系列校准品，样品稀释液，浓缩洗涤液和显色试剂。 10.一种用于检测狂犬病毒抗体的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述使用方法使用权利要求9所述试剂盒，包括以下步骤： 1)从试剂盒中取出已包被有抗原蛋白的抗原包被板，将待检样本用样品稀释液按1:100稀释，每孔100μL加入到抗原包被板中，同时设校准品6孔，每孔加入100μL； 2)轻轻振匀孔中样品，贴上封口膜，置37℃温育60分钟，揭掉封口膜，甩掉孔中的溶液，用稀释好的洗涤液洗板5次，300μL每孔，最后一次在吸水纸上拍干； 3)每孔加酶标记物100μL，贴上封口膜，置37℃温育30分钟，揭掉封口膜，洗涤5次，方法同步骤2)； 4)每孔加显色液A、显色液B各50μL，混匀，贴上封口膜，置37℃避光显色15分钟，揭掉封口膜，每孔加终止液50μL，混匀，30分钟内用酶标仪双波长450/630nm测定各孔OD值； 5)建立吸光度值与抗体浓度的标准曲线，将待测样品吸光度代入标准曲线方程，求得相应样品中G蛋白的抗体含量。
所属类别：	发明专利