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原文传递一种阿片类活性物质的通用检测方法及其检测试剂盒

专利名称：	一种阿片类活性物质的通用检测方法及其检测试剂盒
摘要：	本发明公开了一种阿片类活性物质的通用检测方法及其检测试剂盒，检测试剂盒分为检测组试剂和对照组试剂两种成分，检测组试剂包括稳定表达人源μ型阿片受体MOR1基因的单克隆细胞系MOR1•copGFP/293和细胞内游离钙离子检测荧光探针试剂Fura Red，对照组试剂包括空白对照单克隆细胞系copGFP/293和细胞内游离钙离子检测荧光探针试剂Fura Red；空白对照单克隆细胞系copGFP/293的制备方法为：将pCDH‑CMV‑MCS‑EF1‑copGFP质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V，制备得到EF1‑copGFP慢病毒；将EF1‑copGFP慢病毒感染人胚肾细胞293，得到所述空白对照单克隆细胞系copGFP/293。本发明可实现所有阿片类活性物质的精确、高灵敏的快速检测，可解决新型合成阿片类精神活性物质监管难的问题。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	杭州迈尔德生物科技有限公司
发明人：	范春雷
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-16T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-12T00:00:00+0800
申请号：	CN201910305617.7
公开号：	CN110006866A
代理机构：	杭州浙科专利事务所(普通合伙)
代理人：	周红芳
分类号：	G01N21/64(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	310000 浙江省杭州市长河街道滨安路688号2幢C楼2层218室
主权项：	1.一种阿片类活性物质的通用检测方法，其特征在于包括以下步骤： 1）将阿片受体基因MOR1克隆到一个含有EF1启动表达荧光蛋白的载体的CMV启动子下，构建表达质粒； 2）将步骤1）构建的带荧光蛋白基因的质粒转染到真核永生化细胞，并建立EF1-荧光蛋白基因稳转细胞系，进行培养扩增得到检测组培养液；同样建立转染空白对照质粒，建立空白对照EF1-荧光蛋白基因稳转细胞系，进行培养扩增得到对照组培养液； 3）步骤2）检测组培养液中加入标准品，标准品为吗啡或芬太尼，配制一系列不同标准品浓度的检测组标准液；检测组标准液中分别加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应后，进行检测胞内荧光蛋白的荧光值PF和荧光钙离子的荧光值Ca2+F，以测得的荧光值Ca2+F/荧光值PF比值作为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标绘制标准曲线，计算拟合回归方程； 4）步骤2）检测组培养液和对照组培养液中分别加入待测样本，分别配制得到样本液和对照液，样本液中的待测样本浓度与对照液中的待测样本浓度相同；样本液和对照液中分别加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应后，对反应后的样本液进行检测胞内荧光蛋白的荧光值PF1和荧光钙离子的荧光值Ca2+F1，对反应后的对照液进行检测胞内荧光蛋白的荧光值PF2和荧光钙离子的荧光值Ca2+F2，计算得到荧光值Ca2+F1/荧光值PF1比值与荧光值Ca2+F2/荧光值PF2比值之差，并代入步骤3）回归方程，即可计算出检测样本中的阿片类活性物质含量。 2.根据权利要求1所述的一种阿片类活性物质的通用检测方法，其特征在于步骤1）中，阿片受体基因MOR1为人源μ型阿片受体MOR1基因；荧光蛋白为copGFP。 3. 根据权利要求1所述的一种阿片类活性物质的通用检测方法，其特征在于步骤1）构建的质粒为pCMV-MOR1·EF1-copGFP质粒，其制备过程为：将人源μ型阿片受体MOR1基因克隆到慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP的CMV启动子下，连接酶切位点为EcoR I和Not I，构建真核表达所述pCMV-MOR1·EF1-copGFP质粒。 4.根据权利要求1所述的一种阿片类活性物质的通用检测方法，其特征在于步骤2）中，所述真核永生化细胞为慢病毒包装细胞293V，建立EF1-荧光蛋白基因稳转细胞系的过程为：将pCMV-MOR1·EF1-copGFP质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V，制备得到CMV-MOR1·EF1-copGFP慢病毒，将CMV-MOR1·EF1-copGFP慢病毒感染人胚肾细胞293；并在荧光显微镜下通过挑取克隆的方法获得稳定表达人源μ型阿片受体MOR1基因的单克隆细胞系MOR1·copGFP/293。 5.根据权利要求1所述的一种阿片类活性物质的通用检测方法，其特征在于步骤2）中，所述空白对照质粒为pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒，建立空白对照EF1-荧光蛋白基因稳转细胞系的过程为：将pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V，制备得到EF1-copGFP慢病毒；将EF1-copGFP慢病毒感染人胚肾细胞293，得到空白对照单克隆细胞系copGFP/293。 6.根据权利要求1所述的一种阿片类活性物质的通用检测方法，其特征在于步骤3）中，向检测组培养液加入标准品，配制标准品浓度分别为0.01ng/ml、0.05ng/ml、0.25ng/ml、1.25ng/ml和6.25ng/ml的5种检测组标准液，所述标准品为吗啡。 7.根据权利要求1所述的一种阿片类活性物质的通用检测方法，其特征在于步骤3）中，向检测组培养液加入标准品，配制标准品浓度分别为1pg/ml、3pg/ml、9pg/ml、27pg/ml和81pg/ml的5种检测组标准液，所述标准品为芬太尼。 8. 根据权利要求1所述的一种阿片类活性物质的通用检测方法，其特征在于步骤3）和步骤4）中的细胞内游离钙离子探针试剂均为Fura Red；步骤3）中，进行检测胞内荧光蛋白的荧光值PF和荧光钙离子的荧光值Ca2+F的方法为：用荧光酶标仪进行测试，选择482nm单波长激发，以507nm和640nm双波长检测，其中507nm波长下检测胞内荧光蛋白的荧光值PF，640nm波长下检测荧光钙离子的荧光值Ca2+F。 9.根据权利要求1所述的一种阿片类活性物质的通用检测方法，其特征在于步骤4）中，所述待测样本为吸毒人员的尿液、血液、毛发、头皮屑、汗液或唾液，或者为天然阿片类制品、合成阿片类制品、污水、土壤、水塘中的任意一种。 10. 一种阿片类活性物质的检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒分为检测组试剂和对照组试剂两种成分，所述检测组试剂包括稳定表达人源μ型阿片受体MOR1基因的单克隆细胞系MOR1·copGFP/293和细胞内游离钙离子检测荧光探针试剂Fura Red，所述对照组试剂包括空白对照单克隆细胞系copGFP/293和细胞内游离钙离子检测荧光探针试剂FuraRed；所述空白对照单克隆细胞系copGFP/293的制备方法为：将pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V，制备得到EF1-copGFP慢病毒；将EF1-copGFP慢病毒感染人胚肾细胞293，得到所述空白对照单克隆细胞系copGFP/293。
所属类别：	发明专利