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原文传递一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的阿片类活性物质的检测方法及其检测试剂盒

专利名称：	一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的阿片类活性物质的检测方法及其检测试剂盒
摘要：	本发明公开了一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的阿片类活性物质的检测方法及其检测试剂盒，所述检测试剂盒分为检测组试剂和阴性对照组试剂两种成分，所述检测组试剂包括稳定表达人源μ型阿片受体MOR1基因的单克隆细胞系MOR1/293和细胞内游离钙离子探针试剂Fluo 3‑AM，所述阴性对照组试剂包括稳定表达人源μ型阿片受体MOR1基因的单克隆细胞系MOR1/293、阿片受体拮抗剂和细胞内游离钙离子探针试剂Fluo 3‑AM。本发明的检测方法可实现所有阿片类活性物质的精确、高灵敏的快速检测，无论是天然阿片类产品、还是合成阿片类分子均能够精确快速检测，可解决新型合成阿片类精神活性物质监管难的问题。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	浙江诺迦生物科技有限公司
发明人：	范春雷;程向荣
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-16T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-28T00:00:00+0800
申请号：	CN201910305600.1
公开号：	CN109946450A
代理机构：	杭州浙科专利事务所(普通合伙)
代理人：	周红芳
分类号：	G01N33/533(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	311200 浙江省杭州市萧山区萧山经济技术开发区启迪路198号杭州湾信息港E座16楼
主权项：	1.一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的阿片类活性物质的检测方法，其特征在于包括以下步骤： 1）将阿片受体基因克隆到CMV启动子下，构建真核表达质粒； 2）将步骤1）的真核表达质粒转染到真核永生化细胞，并建立阿片受体稳转细胞系，进行培养扩增得到细胞培养液； 3）步骤2）细胞培养液中加入标准品，配制一系列不同标准品浓度的标准液，所述标准品为吗啡或芬太尼；标准液中分别加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应后进行检测胞内游离荧光钙离子荧光强度，以测得的胞内游离荧光钙离子荧光强度为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标绘制标准曲线，计算拟合回归方程； 4）步骤2）细胞培养液中加入待测样本，配制得到样本液；取2份相同的样本液，其中1份样本液中加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应，对反应后的样本液进行检测胞内游离荧光钙离子荧光强度Y1；另1份样本液中加入过量的阿片受体拮抗剂得到阴性对照液，阴性对照液中加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应，对反应后的阴性对照液进行检测胞内游离荧光钙离子荧光强度Y2；计算荧光强度Y1与荧光强度Y2之差，并带入步骤3）回归方程，即可推算出待测样本中的阿片类活性物质含量。 2.如权利要求1所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的阿片类活性物质的检测方法，其特征在于步骤1）中，阿片受体基因为人源μ型阿片受体MOR1基因。 3. 如权利要求1所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的阿片类活性物质的检测方法，其特征在于步骤1）中，所述真核表达质粒为真核表达pCMV-MOR1质粒，其制备过程为：将人源μ型阿片受体MOR1基因克隆到慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo的CMV启动子下，连接酶切位点为EcoR I和Not I，构建真核表达pCMV-MOR1质粒。 4.如权利要求1所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的阿片类活性物质的检测方法，其特征在于步骤2）中，建立阿片受体稳转细胞系的过程为：将pCMV-MOR1质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V制备CMV-MOR1慢病毒；将CMV-MOR1慢病毒感染人胚肾细胞293得到转染CMV-MOR1的293细胞，用含新霉素G418的条件培养基筛选稳转CMV-MOR1的293细胞，并通过挑取克隆的方法获得稳定表达人源μ型阿片受体MOR1基因的单克隆细胞系MOR1/293。 5.如权利要求1所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的阿片类活性物质的检测方法，其特征在于步骤3）中，向细胞培养液中加入标准品，配制标准品浓度分别为0.01、0.05、0.25、1.25、6.25ng/ml的5种标准液，所述标准品为吗啡。 6.如权利要求1所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的阿片类活性物质的检测方法，其特征在于步骤3）中，向细胞培养液中加入标准品，配制标准品浓度分别为1、3、9、27、81pg/ml的5种标准液，所述标准品为芬太尼。 7.如权利要求1所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的阿片类活性物质的检测方法，其特征在于步骤4）中，所述待测样本为吸毒人员的尿液、血液、毛发、头皮屑、汗液或唾液，或者为天然大麻、天然大麻制品、合成大麻、合成大麻制品、污水、土壤、水塘中的任意一种；步骤4）中，所述阿片受体拮抗剂为纳美芬。 8. 如权利要求1所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的阿片类活性物质的检测方法，其特征在于步骤3）和步骤4）中的细胞内游离钙离子探针试剂均为Fluo 3-AM；步骤3）中，进行检测胞内游离荧光钙离子荧光强度的方法为：用荧光酶标仪进行测试，选择488nm波长激发，以526nm波长检测胞内游离荧光钙离子荧光强度。 9. 一种阿片类活性物质的检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒分为检测组试剂和阴性对照组试剂两种成分，所述检测组试剂包括稳定表达人源μ型阿片受体MOR1基因的单克隆细胞系MOR1/293和细胞内游离钙离子探针试剂Fluo 3-AM，所述阴性对照组试剂包括稳定表达人源μ型阿片受体MOR1基因的单克隆细胞系MOR1/293、阿片受体拮抗剂和细胞内游离钙离子探针试剂Fluo 3-AM。
所属类别：	发明专利