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原文传递一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒

专利名称：	一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒
摘要：	本发明公开了一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒，所述检测试剂盒包括检测组试剂盒和对照组试剂盒两种成分，所述检测组试剂盒包括稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1/SK‑N‑SH和ELISA检测试剂盒，所述对照组试剂盒包括空白对照细胞系Neo/SK‑N‑SH和ELISA检测试剂盒。本发明可实现所有大麻素类活性物质的精确、高灵敏的快速检测，无论是天然大麻素、还是合成大麻素，包括层出不穷的新型合成大麻素活性物质，可解决大麻类精神活性物质监管难的问题，快速、高效、精准、高通量的检测各种样品中的大麻素类活性物质。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	浙江诺迦生物科技有限公司
发明人：	范春雷;程向荣
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-16T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-07T00:00:00+0800
申请号：	CN201910306029.5
公开号：	CN109856394A
代理机构：	杭州浙科专利事务所(普通合伙)
代理人：	周红芳
分类号：	G01N33/558(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	311200 浙江省杭州市萧山区萧山经济技术开发区启迪路198号杭州湾信息港E座16楼
主权项：	1.一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于包括以下步骤： 1）将人源大麻素受体CB1基因克隆到慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo的CMV启动子下，连接酶切位点为EcoR I和Not I，构建真核表达pCMV-CB1质粒； 2）将步骤1）pCMV-CB1质粒转染到神经母细胞瘤细胞，并建立CB1稳转的神经母细胞瘤细胞系，进行培养扩增得到检测组细胞培养液；同时以慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo为对照空载体，建立一个转染对照空载体的神经母细胞瘤细胞系，进行培养扩增得到对照组细胞培养液； 3）步骤2）检测组细胞培养液中加入四氢大麻酚并充分反应，配制一系列不同四氢大麻酚浓度的标准液；将标准液离心分离后，取上清液并用ELISA检测试剂盒检测多巴胺效应下的吸光度OD值，以测得的吸光度OD值为纵坐标，以标准液中的四氢大麻酚浓度为横坐标绘制标准曲线，计算拟合回归方程； 4）步骤2）检测组细胞培养液中加入待测样本，充分反应，离心分离后取上清液，对反应后的检测组细胞培养液的上清液用ELISA检测试剂盒检测多巴胺效应下的吸光度OD1值；步骤2）对照组细胞培养液中加入待测样本，充分反应，离心分离后取上清液，对反应后的对照组细胞培养液的上清液用ELISA检测试剂盒检测多巴胺效应下的吸光度OD2值；计算吸光度OD1值与吸光度OD2值之差，并带入步骤3）回归方程，即可推算出待测样本中的大麻素类活性物质的效应含量。 2.如权利要求1所述的一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤2）中，神经母细胞瘤细胞为SK-N-SH细胞。 3.如权利要求2所述的一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤2）中，建立CB1稳转的神经母细胞瘤细胞系的过程为：将pCMV-CB1质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V，制备得到CMV-CB1慢病毒；将CMV-CB1慢病毒感染SK-N-SH细胞得到CB1/SK-N-SH稳转细胞，用含新霉素G418的条件培养基筛选CB1/SK-N-SH稳转细胞，并通过挑取克隆的方法获得稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1/SK-N-SH。 4.如权利要求2所述的一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤2）中，建立转染对照空载体的神经母细胞瘤细胞系的过程为：将pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo对照空载体、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V，制备得到空载体慢病毒；将空载体慢病毒感染SK-N-SH细胞得到Neo/SK-N-SH稳转细胞，用含新霉素G418的条件培养基筛选Neo/SK-N-SH稳转细胞，并通过挑取克隆的方法获得空白对照细胞系Neo/SK-N-SH。 5.如权利要求1所述的一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤3）中，向检测组细胞培养液中加入四氢大麻酚并充分反应，配制四氢大麻酚浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6ng/mL的5种标准液；其中进行充分反应的过程为：混匀，35~40℃反应3~10分钟。 6.如权利要求1所述的一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤4）中，其中进行充分反应的过程为：混匀，35~40℃反应3~10分钟。 7.如权利要求1所述的一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤4）中，所述待测样本为吸毒人员的尿液、血液、毛发、头皮屑、汗液或唾液，或者为天然大麻、天然大麻制品、合成大麻、合成大麻制品、污水、土壤、水塘中的任意一种。 8.一种大麻素类活性物质的检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒包括检测组试剂盒和对照组试剂盒两种成分，所述检测组试剂盒包括稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1/SK-N-SH和ELISA检测试剂盒，所述对照组试剂盒包括空白对照细胞系Neo/SK-N-SH和ELISA检测试剂盒。
所属类别：	发明专利