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原文传递一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒

专利名称：	一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒
摘要：	本发明公开了一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒，所述检测试剂盒分为检测组试剂和阴性对照组试剂两种成分，所述检测组试剂包括稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1/293和细胞内游离钙离子探针试剂Fluo 3‑AM，所述阴性对照组试剂包括稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1/293、细胞内游离钙离子探针试剂Fluo 3‑AM以及大麻素受体拮抗剂。本发明可实现所有大麻素类活性物质的精确、高灵敏的快速检测，无论是天然大麻素、还是合成大麻素，包括层出不穷的新型合成大麻素活性物质，可解决大麻类精神活性物质监管难的问题。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	浙江诺迦生物科技有限公司
发明人：	范春雷;程向荣
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-16T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-28T00:00:00+0800
申请号：	CN201910305620.9
公开号：	CN109946451A
代理机构：	杭州浙科专利事务所(普通合伙)
代理人：	周红芳
分类号：	G01N33/533(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	311200 浙江省杭州市萧山区萧山经济技术开发区启迪路198号杭州湾信息港E座16楼
主权项：	1.一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于包括以下步骤： 1）将大麻素受体CB1基因克隆到CMV启动子下构建真核表达质粒，将所述真核表达质粒转染到真核永生化细胞，并建立CB1稳转细胞系，进行培养扩增得到细胞培养液； 2）步骤1）细胞培养液中加入四氢大麻酚，配制一系列不同四氢大麻酚浓度的5种标准液，将每种四氢大麻酚浓度的标准液均分为相同的2份；其中1份标准液中加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应，对反应后的标准液进行检测胞内游离荧光钙离子荧光值Y1；另1份标准液中加入过量的大麻素受体拮抗剂得到阴性标准液，阴性标准液中加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应，对反应后的阴性标准液进行检测胞内游离荧光钙离子荧光值Y2；以荧光值Y1与荧光值Y2之差为纵坐标，以四氢大麻酚的浓度为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程； 3）步骤1）细胞培养液中加入待测样本，配制得到样本液；取2份相同的样本液，其中1份样本液中加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应，对反应后的样本液进行检测胞内游离荧光钙离子荧光值Y3；另1份样本液中加入过量的大麻素受体拮抗剂得到阴性样本液，阴性样本液中加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应，对反应后的阴性样本液进行检测胞内游离荧光钙离子荧光值Y4；计算荧光强度Y3与荧光强度Y4之差，并带入步骤2）回归方程，即可推算出待测样本中的大麻素类活性物质含量。 2. 如权利要求1所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤1）中，所述大麻素受体CB1基因为人源大麻素受体CB1基因；所述真核表达质粒为pCMV-CB1质粒，其制备过程为：将人源大麻素受体CB1基因克隆到慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo的CMV启动子下，连接酶切位点为EcoR I和Not I，构建所述pCMV-CB1质粒。 3.如权利要求2所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤1）中，建立CB1稳转细胞系的过程为：将pCMV-CB1质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V，制备得到CMV-CB1慢病毒；将CMV-CB1慢病毒感染人胚肾细胞293得到稳转CMV-CB1的293细胞，用含新霉素G418的条件培养基筛选稳转CMV-CB1的293细胞，并通过挑取克隆的方法获得稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1/293。 4.如权利要求1所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤2）中，向细胞培养液中加入四氢大麻酚，配制四氢大麻酚浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6ng/mL的5种标准液。 5.如权利要求1所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤2）中，所述大麻素受体拮抗剂为Pyrazoles、Triazoles、Imidazoles或NESS 0327。 6.如权利要求1所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤3）中，所述待测样本为吸毒人员的尿液、血液、毛发、头皮屑、汗液或唾液，或者为天然大麻、天然大麻制品、合成大麻、合成大麻制品、污水、土壤、水塘中的任意一种。 7. 如权利要求1所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤2）和步骤3）中的细胞内游离钙离子探针试剂均为Fluo 3-AM；步骤3）中，进行检测胞内游离荧光钙离子荧光强度的方法为：用荧光酶标仪进行测试，选择488nm波长激发，以526nm波长检测胞内游离荧光钙离子荧光值。 8. 一种大麻素类活性物质的检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒分为检测组试剂和阴性对照组试剂两种成分，所述检测组试剂包括稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1/293和细胞内游离钙离子探针试剂Fluo 3-AM，所述阴性对照组试剂包括稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1/293、细胞内游离钙离子探针试剂Fluo 3-AM以及大麻素受体拮抗剂。
所属类别：	发明专利