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原文传递一种微生物传感器的构建方法及其应用方法

专利名称：	一种微生物传感器的构建方法及其应用方法
摘要：	本发明提供了一种微生物传感器的构建方法及应用方法，步骤一构建待测氨基酸缺陷型菌株；步骤二截取LuxI/LuxR循环放大线路所需目的基因片段连接，得到含有基于LuxI/LuxR系统的循环放大线路的质粒，将重组质粒转化到氨基酸缺陷型菌株中，使报告基因片段重复表达；步骤三将菌株培养至对数生长期，在培养基中饥饿培养。本发明利用循环放大待测氨基酸缺陷型菌株作为微生物传感器，以与蛋白质标志物具有高特异性和高亲和力结合的核酸适配体作为“桥梁”，将对蛋白标志物的检测转化为对待测氨基酸的检测，利用构建的微生物传感器实现了对大分子生物标志物的检测，并且结合循环放大系统作为信号放大手段，大大提高了定量检测的灵敏度。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	北京理工大学
发明人：	吕雪飞;张静;邓玉林;陶慧;杨元展
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-07T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-12T00:00:00+0800
申请号：	CN201910376520.5
公开号：	CN110007072A
代理机构：	北京宣言律师事务所
代理人：	李知伦
分类号：	G01N33/533(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	100044 北京市海淀区中关村南大街5号
主权项：	1.一种微生物传感器的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一构建待测氨基酸的缺陷型菌株；步骤二构建以荧光蛋白基因为报告基因的质粒，截取LuxI/LuxR循环放大线路所需目的基因片段，连接构建，得到含有基于LuxI/LuxR系统的循环放大线路的质粒，将重组质粒转化到感受态的由步骤一中获得的菌株中，使报告基因片段重复表达，获得具有信号循环放大能力的微生物传感器；步骤三将步骤二中获得的菌株培养至对数生长期，在培养基中饥饿培养，耗尽菌株中内源性的待测氨基酸分子。 2.根据权利要求1所述的微生物传感器的构建方法，其特征在于，其中步骤二包括以下步骤：步骤二a构建以荧光蛋白基因为报告基因的质粒，提取质粒，转化到感受态的待测氨基酸缺陷型菌株中，筛选阳性菌落，得到报告基因菌株荧光传感体系；步骤二b从质粒载体上双酶切获得循环放大线路所需目的基因片段，通过T4 DNA连接酶进行顺次连接，完成循环放大线路质粒的构建；步骤二c将构建完成的质粒转化到感受态细胞中，涂布对应抗性的LB平板，筛选阳性单克隆；步骤二d将阳性单克隆接种于对应抗性的液体LB培养基进行扩大培养，然后提取质粒，转化到感受态的步骤一中获得的菌株中，涂布对应抗性的LB平板，筛选阳性单克隆，获得循环放大待测氨基酸缺陷型菌株，即将待测氨基酸信号放大的微生物传感器。 3.根据权利要求2所述的微生物传感器的构建方法，其特征在于，在步骤二a后还包括步骤二a1：对报告基因菌株荧光传感体系进行饥饿培养消耗掉内源性待测氨基酸分子，并检测报告基因菌株荧光传感体系对待测氨基酸的响应敏感度。 4.根据权利要求1所述的微生物传感器的构建方法，其特征在于，还包括步骤四向微生物传感器菌液中分别添加具有浓度梯度的待测氨基酸溶液，培养菌液，并分别检测荧光强度，构建待测氨基酸浓度与荧光强度的工作曲线，检测微生物传感器对待测氨基酸的响应敏感度。 5.根据权利要求1所述的微生物传感器的构建方法，其特征在于，所述荧光蛋白基因为gfp基因、yfp基因、rfp基因或bfp基因中的一种或几种，所述检测氨基酸为赖氨酸、甘氨酸、色氨酸、丝氨酸或亮氨酸，所述菌株为大肠杆菌或酵母菌。 6.根据权利要求2所述的微生物传感器的构建方法，其特征在于，所述所需目的基因片段分别为组成型启动子Pj23100-RBS、诱导酰基高丝氨酸内酯的受体结合蛋白基因Plux-RBS-luxR、酰基高丝氨酸内酯合成酶基因RBS-luxI和绿色荧光蛋白基因RBS-gfp-T-T。 7.根据权利要求1所述的微生物传感器的构建方法，其特征在于，所述待测氨基酸为单体氨基酸或多肽。 8.一种应用权利要求1所述的微生物传感器的蛋白生物标志物定量检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一根据待测蛋白生物标志物选择核酸适配体，在磁珠-核酸适配体偶联物中加入互补链，所述互补链末端修饰待测氨基酸分子，得到磁珠-核酸适配体-互补链的偶联物；步骤二将不同浓度梯度的蛋白生物标志物及待测样品分别加入到磁珠-核酸适配体-互补链的偶联物中，蛋白标志物与互补链竞争结合核酸适配体，蛋白质标志物与核酸适配体结合，释放出互补链；步骤三磁分离后，分别向互补链游离溶液中加入所述微生物传感器，进行菌株培养；步骤四检测菌液里的荧光强度，绘制荧光强度与蛋白生物标志物浓度之间的标准曲线，根据标准曲线计算待测样品中蛋白标志物的浓度。 9.根据权利要求8所述的蛋白标志物定量检测的方法，其特征在于，所述磁珠-互补链偶联物通过链霉亲和素-生物素系统偶联。 10.根据权利要求8所述的蛋白标志物定量检测的方法，其特征在于，所述互补链分子与核酸适配体的左侧15nt碱基互补配对。
所属类别：	发明专利