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原文传递一种定性定量分析非酶糖基化血浆白蛋白的方法

专利名称：	一种定性定量分析非酶糖基化血浆白蛋白的方法
摘要：	本发明涉及一种定性定量分析非酶糖基化血浆白蛋白的方法，将血浆白蛋白还原烷基化和胰蛋白酶酶解后，通过“纳升液相色谱‑多级质谱(nL‑MSn)结合“同位素标记的相对定量和绝对定量技术(iTRAQ)”定性定量分析血浆白蛋白非酶糖基化。通过还原烷基化及胰蛋白酶酶解将血浆白蛋白降解成肽段，通过纳升液相分离后再通过高分辨率质谱获取氨基酸序列、糖基化位点信息，并通过iTRAQ报告离子实现糖基化位点的准确定量。本发明实现了对血浆白蛋白糖基化位点全面的定性和定量分析，可用于监测血糖浓度和早期糖尿病的检测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山东;37
申请人：	山东大学
发明人：	迟连利;崔雪莹;仇红燕;张群业;王哲;张馨洁
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-22T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-16T00:00:00+0800
申请号：	CN201910222671.5
公开号：	CN110018249A
代理机构：	济南金迪知识产权代理有限公司
代理人：	陈桂玲
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	250199 山东省济南市历城区山大南路27号
主权项：	1.一种定性定量分析非酶糖基化血浆白蛋白的方法，其特征在于，包括步骤如下： (1)在血浆中加入PEG-6000，采用PEG沉淀法除去血浆中的球蛋白，保留含有血浆白蛋白的上清液待用；定性分析进入步骤(2)，定量分析进入步骤(3)； (2)采用亲和色谱分离糖基化HSA； (3)HSA还原烷基化； (4)将胰蛋白酶加入还原烷基化后的蛋白质溶液中，胰蛋白酶与蛋白质溶液的质量比为1:25，在37℃下孵育过夜；定性分析进入步骤(8)，定量分析进入步骤(5)； (5)标记用于定量实验的酶解HSA； (6)采用亲和色谱柱分离标记后的糖基化HSA肽段； (7)C18 Ziptip脱盐；定量分析进入步骤(9)； (8)纳升液相色谱-多级质谱定性分析：将步骤(4)中经过胰蛋白酶酶解的糖基化HSA溶于去离子水，配制成浓度为1μg/uL的溶液；流动相A：含0.1％甲酸的2％乙腈溶液；流动相B：含0.1％甲酸的98％乙腈溶液；用ReproSil-Pur C18-AQ Trap色谱柱和ReproSil-Pur C18-AQ色谱柱分离，流速为300nL/min，洗脱梯度如下，均为体积百分比：0～5min，0％流动相B；5～20min，0％～10％流动相B；20～65min，10％～32％流动相B；65～85min，32％～50％流动相B；85～90min，50％～100％流动相B；90～100min，100％流动相B；100～102min，100％～0％流动相B；102～120min，0％流动相B；定性分析进入步骤(10)； (9)纳升液相色谱-多级质谱-iTRAQ标记定量分析：将步骤(7)中经过胰蛋白酶酶解的iTRAQ标记的糖基化HSA溶于去离子水，配制成浓度为1μg/uL的溶液；流动相A：含0.1％甲酸的2％乙腈溶液；流动相B：含0.1％甲酸的98％乙腈溶液；用ReproSil-Pur C18-AQ Trap色谱柱和ReproSil-Pur C18-AQ色谱柱分离，流速为300nL/min，洗脱梯度如下，均为体积百分比：0～5min，0％流动相B；5～20min，0％～10％流动相B；20～65min，10％～32％流动相B；65～85min，32％～50％流动相B；85～90min，50％～100％流动相B；90～100min，100％流动相B；100～102min，100％～0％流动相B；102～120min，0％流动相B；定量分析进入步骤(11)； (10)在正离子模式下用高分辨质谱仪进行定性分析，得到高分辨质谱图；定性分析进入步骤(12)； (11)在正离子模式下用高分辨质谱仪进行定量分析，得到高分辨质谱图；定量分析进入步骤(13)； (12)根据步骤(10)中获得的高分辨质谱图，使用Proteome Discoverer软件实现对HSA糖基化位点的定性分析； (13)根据步骤(11)中获得的高分辨质谱图，使用Proteome Discoverer软件实现对HSA糖基化位点的定量分析。 2.根据权利要求1所述的一种定性定量分析非酶糖基化血浆白蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，PEG沉淀法去除血浆中的球蛋白，包括步骤如下：在新鲜血浆中加入适量的PEG-6000，其中血浆与PEG-6000的体积质量比为1μL:100μg，振荡混匀后，4℃离心，取含有HSA的上清液待用。 3.根据权利要求1所述的一种定性定量分析非酶糖基化血浆白蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(2)，亲和色谱分离采用TSK-gel Boronate-5PW亲和色谱分离糖基化HSA，包括步骤如下：流动相A：250mM NH4Ac，50mM MgCl2，5％CH3OH，pH＝8.5；流动相B：200mM Sorbitol，100mM Tris，50mM EDTA-2Na，H2O，pH＝8.5； TSK-gel Boronate-5PW色谱柱分离，流速为0.6mL/min，使用紫外检测器280nm检测糖基化HSA和非糖基化HSA的保留时间；流动相A平衡色谱柱后30min后进样，100％流动相A洗脱接样得非糖基化HSA，待基线再次平稳后，切换流动相B，100％流动相B洗脱接样得糖基化HAS；将得到的糖基化HSA超滤脱盐冻干。 4.根据权利要求1所述的一种定性定量分析非酶糖基化血浆白蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(3)，HSA还原烷基化，包括步骤如下：变性缓冲溶液：0.5M Tris-HCl，2.75mM EDTA，6 M Guanadine-HCl，pH＝8.0～8.2；将适量的变性缓冲溶液，1M DTT，1M IA依次加入到HSA中，其中变性缓冲液，DTT，IA，HSA的体积质量比为15μL:3μL:5μL:10μg，加入DTT后应在37℃孵育2h后再加入IA，加入IA后于暗处放置1h；超滤时用300～400μL 25μM的NH4HCO3，4℃洗涤离心3～4次，每次10～15min，取膜上部分。 5.根据权利要求1所述的一种定性定量分析非酶糖基化血浆白蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(5)，采用iTRAQ8-plex试剂标记用于定量实验的酶解HSA，包括步骤如下：500μM TEAB溶解酶解后样品，其中TEAB与样品的体积质量比为1μL:16μg；iTRAQ试剂加入异丙醇，混匀后加入样品，其中有机试剂占终体积的比例不能低于75％，混合液于30℃孵育3h，加入H2O作为终止液，室温放置30min～40min，冻干。 6.根据权利要求1所述的一种定性定量分析非酶糖基化血浆白蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(6)，采用TSK-gel Boronate-5PW色谱柱分离iTRAQ标记的糖基化HSA肽段，包括步骤如下：流动相A：250mM NH4Ac，50mM MgCl2，5％CH3OH，pH＝8.5；流动相B：200mM Sorbitol，100mM Tris，50mM EDTA-2Na，H2O，pH＝8.5； TSK-gel Boronate-5PW色谱柱分离，流速为0.6mL/min，使用紫外检测器，280nm检测标记糖基化HSA肽段和标记非糖基化HSA肽段的保留时间；流动相A平衡色谱柱后30min后进样，100％流动相A洗脱接样得标记非糖基化HSA肽段，待基线再次平稳后，切换流动相B，100％流动相B洗脱接样得标记糖基化HSA肽段。 7.根据权利要求1所述的一种定性定量分析非酶糖基化血浆白蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(7)，C18 Ziptip脱盐，包括步骤如下：流动相A：100％ACN；流动相B：0.1％TFA；流动相C：80％ACN，20％H2O，0.1％TFA； C18 Ziptip流动相A洗3～4次，流动相B洗3～4次，上样后吹打样品15～20次，流动相B洗7～8次，流动相C洗脱样品，转干。 8.根据权利要求1所述的一种定性定量分析非酶糖基化血浆白蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(10)中，高分辨质谱仪为线性离子阱轨道阱高分辨质谱仪，型号为LTQ-Orbitrap Velos Pro，设定参数如下：Spray voltage：+2.1kV；Capillary temp：275℃；S-lens RF level：60％；Scan range：350～1650；Resolution：60,000；Collision energy：35％；采用数据依赖模式，选取“top10”的母离子用于CID-MS2分析。 9.根据权利要求1所述的一种定性定量分析非酶糖基化血浆白蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(11)中，所述高分辨质谱仪为线性离子阱轨道阱高分辨质谱仪，型号为LTQ-Orbitrap Fusion，设定参数如下：Spray voltage：+2.4kV；Capillary temp：275℃；RFLens：60％；Scan range：350～1550；Resolution：60,000；Isolation window：2；采用数据依赖模式，选取“top15”和“top10”的母离子分别用于CID-MS2和HCD-MS3分析；MS detector：Orbitrap；MS2 detector：Ion Trap；MS3 detector：Orbitrap；仅对离子强度阈值达到5000的离子进行MS2分析；CID Collision Energy：35％；HCD Collision Energy：55％；MS AGCTarget：2.0e5；MS2 AGC Target：1.0e4；MS3 AGC Target：5.0e4；MS Maximum InjectionTime：50ms；MS2 Maximum Injection Time：100ms；MS3 Maximum Injection Time：150ms。 10.根据权利要求1所述的一种定性定量分析非酶糖基化血浆白蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(12)中，Proteome Discoverer软件定性分析的参数如下：蛋白质数据库：human database；酶：Trypsin；最多允许漏切位点：2；MS容差范围：10ppm；MS/MS容差范围：0.8Da；可变修饰：甲硫氨酸氧化，+15.9950Da；赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸和蛋白质N-末端的葡萄糖基化，+162.0528Da；固定修饰：半胱氨酸氨基甲酰化，+57.0215Da；所述步骤(13)中，Proteome Discoverer软件定量分析的参数如下：蛋白质数据库：human database；酶：Trypsin；最多允许漏切位点：2；MS容差范围：10ppm；MS/MS容差范围：0.8Da；可变修饰：甲硫氨酸氧化，+15.9950Da；赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸和蛋白质N-末端的葡萄糖基化，+162.0528Da；赖氨酸和酪氨酸iTRAQ标记，+304.205Da；固定修饰：半胱氨酸氨基甲酰化，+57.0215Da；肽的任意N末端iTRAQ标记，+304.205Da；质谱仪：FTMS；MS order：MS3；碎裂方式：HCD。
所属类别：	发明专利