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原文传递一种人血浆中阿考替胺的定量分析方法

专利名称：	一种人血浆中阿考替胺的定量分析方法
摘要：	本发明涉及一种人血浆中阿考替胺的定量分析方法，属于生物分析领域。本发明采用蛋白沉淀处理人血浆样本，以阿考替胺‑d6为内标采用超高效液相色谱‑质谱联用(UPLC‑MS/MS)方法检测人血浆中阿考替胺的含量。采用本发明的检测方法，灵敏度高、专属性强、稳定性高、回收率高达90％，既能满足回收率的要求，又可以提高检测效率。此外，本检测方法的重现性好，分析时间短，能满足阿考替胺在人血浆中浓度的检测要求，可用于阿考替胺片剂药代动力学研究和生物等效性研究。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	南京工业大学
发明人：	杨雨菲;孙莉莉
专利状态：	有效
申请日期：	2019-02-20T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-31T00:00:00+0800
申请号：	CN201910126976.6
公开号：	CN109828043A
代理机构：	南京思拓知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	吕鹏涛
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	211816 江苏省南京市浦口区浦珠南路30号
主权项：	1.一种人血浆中阿考替胺的定量分析方法，其特征在于，将待测人血浆样品通过蛋白沉淀法对待测样品处理后，采用乙酸铵水和甲醇作为混合流动相进行LC-MS/MS分析测定。 2.根据权利要求1所述的人血浆中阿考替胺的定量分析方法，其特征在于，所述乙酸铵水中乙酸铵的浓度为5mM；优选为含甲酸的乙酸铵水；更优选，含甲酸的体积为乙酸铵水的总体积的0.1％。 3.根据权利要求1所述的人血浆中阿考替胺的定量分析方法，其特征在于，采用ZorbaxXDB-C18作为色谱柱，优选该色谱柱的长度为50mm，直径为2.1mm，填料粒径为3.4μm。 4.根据权利要求1、2或3所述的人血浆中阿考替胺的定量分析方法，其特征在于，采用阿考替胺-d6作为内标。 5.根据权利要求4所述的人血浆中阿考替胺的定量分析方法，其特征在于，待测样品加入内标沉淀剂，涡旋、离心后取上清进行LC-MS/MS分析测定。 6.根据权利要求5所述的人血浆中阿考替胺的定量分析方法，其特征在于，它包括以下步骤： (1)标准工作溶液的配制：称取阿考替胺，加入甲醇，配制成浓度为1.00mg/mL的阿考替胺储备液，将所述阿考替胺储备液用体积比为1:1的甲醇-水溶液稀释成梯度为0.4～2000ng/mL的阿考替胺工作溶液；按上述步骤重复一次，配置成梯度浓度为0.4～1600ng/mL的阿考替胺平行工作溶液；称取阿考替胺-d6，加入甲醇配置成浓度为1.00mg/mL的内标储备液，再用体积比为1:1的甲醇-水溶液稀释成0.01mg/mL的内标工作液，将所述的内标工作液用体积比1:1的甲醇-乙腈溶液稀释成5ng/mL的内标沉淀剂；所有储备液、工作液及内标沉淀剂在4℃下保存，备用；取健康人空白血浆，分别加入所述阿考替胺工作溶液，涡旋混匀，配置成相应梯度的校正标样，其浓度范围为0.02～100ng/mL；取健康人空白血浆，分别加入所述阿考替胺平行工作溶液，涡旋混匀，配置成响应梯度的质控样品，其浓度范围为0.06～80ng/mL； (2)样品处理：取等体积的校正标样、质控样品、待测生物样品和空白人血浆，向校正标样、质控样品、待测生物样品中分别加入所述内标沉淀剂，向空白人血浆和水中分别加入体积比为1:1的甲醇-乙腈溶液，涡旋混匀、离心，取上清； (3)标准曲线制作：将经步骤(2)处理后的校正标样、质控样品的上清进行LC-MS/MS分析测定，以阿考替胺和内标阿考替胺-d6的色谱峰面积比为纵坐标，以人血浆中阿考替胺浓度为横坐标制作标准曲线； (4)定量分析：将经步骤(2)处理后的待测生物样品，按照步骤(3)所得的标准曲线方程计算，得到待测生物样品中阿考替胺的浓度。 7.根据权利要求6所述的人血浆中阿考替胺的定量分析方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述阿考替胺工作溶液浓度为：0.4000ng/mL、1.000ng/mL、2.000ng/mL、4.000ng/mL、20.00ng/mL、100.0ng/mL、500.0ng/mL、1000ng/mL、1800ng/mL、2000ng/mL；所述阿考替胺平行工作溶液浓度为：0.4000、1.200、60.00、1600ng/mL；所述校正标样和所述质控样品为新鲜配制；所述校正标样的浓度为：0.020ng/mL、0.050ng/mL、0.100ng/mL、0.200ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL、25.0ng/mL、50.0ng/mL、90.0ng/mL、100ng/mL；所述质控样品的浓度为：0.02ng/mL、0.06ng/mL、3.0ng/mL、80ng/mL。 8.根据权利要求6所述的人血浆中阿考替胺的定量分析方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述涡旋混匀的时间为10min；所述离心的条件为：离心时温度为4℃；离心的转速为4000rpm；离心的时间为10min。 9.根据权利要求6所述的人血浆中阿考替胺的定量分析方法，其特征在于，在步骤(3)中采用LC-MS/MS分析测定时，色谱条件还包括：柱温箱温度为40℃；流速为0.6mL/min；所述色谱条件优选为，进样体积5μL；自动进样器强洗溶液为：甲醇:乙腈:异丙醇:水的体积比为1:1:1:1；自动进样器弱洗溶液为：乙腈:水的体积比为3:7；自动进样器洗针体积为：500μL；自动进样针清洗时浸泡时间0s；自动进样器清洗模式：进样器前和进样后清洗；样品盘温度：5℃；质谱条件为：离子源为ESI源，采用正离子模式、多反应监测模式；电喷雾电压为5000V；温度为500℃；气帘气为45psi；碰撞气为6psi；喷雾气为60pis；辅助加热气为70psi。 10.根据权利要求6所述的人血浆中阿考替胺的定量分析方法，其特征在于，在步骤(3)中，LC-MS/MS分析测定时阿考替胺的监测离子对为451.3/271.2，每次扫描一个离子时所停留的时间100ms，去簇电压120V，碰撞能量33V；阿考替胺-d6的监测离子对为457.2/271.2，每次扫描一个离子时所停留的时间100ms，去簇电压120V，碰撞能量33V。
所属类别：	发明专利