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原文传递一种测定人血浆中两种抗肿瘤药物浓度的HPLC-MSMS方法

专利名称：	一种测定人血浆中两种抗肿瘤药物浓度的HPLC-MSMS方法
摘要：	本发明公开了一种测定人血浆中两种抗肿瘤药物及代谢产物和代谢酶活性相关内源性物质浓度的方法，包括预处理及分别以伏立康唑和溴尿嘧啶为内标，经预处理后样本均使用高效液相色谱分离上清液中的药物成分，然后使用高分辨质谱多反应监测模式进行药物靶向性检测，并进行定量，实现对血浆中两种抗肿瘤药物及代谢产物和代谢酶活性相关内源性物质浓度进行分析测定。本方法在具有快捷性的同时，兼具极高的靶向性，表现出快速、高通量、高灵敏度、特异性强、精密度和准确度良好、稳定性好、提取回收率高、无明显基质效应和稀释效应等优点。本方法可用于临床上伊立替康及其代谢产物和氟尿嘧啶及其代谢酶活性相关内源性物质的血药浓度监测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	上海;31
申请人：	上海市第一人民医院
发明人：	范国荣;汪硕闻;范先煜;潘慧;张令;周利娟;秦淑娜;王玉勤;周金金
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-24T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-23T00:00:00+0800
申请号：	CN201910440341.3
公开号：	CN110045048A
代理机构：	上海卓阳知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	曹翠娟
分类号：	G01N30/06(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	200080 上海市虹口区海宁路100号
主权项：	1.一种测定人血浆中两种抗肿瘤药物及代谢产物和代谢酶活性相关内源性物质浓度的方法，其特征在于，所述两种抗肿瘤药物分别是伊立替康和氟尿嘧啶，所述代谢产物是伊立替康的两种代谢产物：7-乙基-10-羟基喜树碱和葡萄糖醛酸化SN-38；所述代谢酶活性相关内源性物质是氟尿嘧啶代谢酶活性相关内源性物质：尿嘧啶和二氢尿嘧啶；所述方法为高效液相色谱-串联质谱法，所述方法包括如下步骤： (1)求得第一标准曲线； (2)求得第二标准曲线； (3)血浆样本预处理：取血浆样本，首先加入内标伏立康唑的甲醇水溶液，然后加入含甲酸体积分数0.1％的甲醇沉淀，取上清用氮气吹干后，再用体积分数5％的甲醇水溶液和二氯甲烷复溶，得到第一血浆样本；取血浆样本，首先加入内标溴尿嘧啶的甲醇水溶液，然后加入体积比为：乙酸乙酯：异丙醇＝85:15的溶液沉淀，取上清用氮气吹干后，再用体积分数5％的甲醇水溶液和二氯甲烷复溶，得到第二血浆样本； (4)将步骤(3)预处理后得到的第一、第二血浆样本分别于高效液相色谱质谱联用仪上进样分析：色谱条件：色谱柱为：Waters Atlantis T3柱；流动相为流动相A和流动相B，流动相梯度洗脱条件见下表，流动相A为100％甲醇；流动相B为体积分数为0.1％的甲酸水溶液；时间(min) 有机相比例(％) 流速(mL/min) 2.0 5 0.35 2.1 40 0.35 5.0 40 0.35 5.1 75 0.30 8.5 75 0.30 9.0 5 0.35 12.0 5 0.35 质谱条件：离子源：电喷雾离子源ESI；离子检测方式：多反应监测MRM；质谱检测工作参数见下表： (5)计算：采用内标法，分别将伊立替康/7-乙基-10-羟基喜树碱SN-38/葡萄糖醛酸化SN-38与内标伏立康唑的峰面积比值带入第一标准曲线方程分别计算得到血浆中伊立替康、7-乙基-10-羟基喜树碱和葡萄糖醛酸化SN-38的浓度；将氟尿嘧啶/尿嘧啶/二氢尿嘧啶和内标溴尿嘧啶的峰面积比值带入第二标准曲线方程计算得到血浆中氟尿嘧啶、尿嘧啶和二氢尿嘧啶的浓度。 2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)中求得第一标准曲线的方法如下：取空白血浆，加入药物的甲醇水溶液和内标伏立康唑的甲醇水溶液，分别制得各种药物一系列浓度的标准曲线血浆样本；采用3倍体积的含甲酸体积分数0.1％的甲醇沉淀标准曲线血浆样本中蛋白；再在高效液相色谱质谱联用仪上进样分析，记录标准曲线血浆样本的色谱图，计算药物峰面积和内标峰面积的比值，然后以药物浓度为横坐标，以药物峰面积和内标峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，求得回归方程即为第一标准曲线；其中，所述药物是伊立替康及其代谢产物7-乙基-10-羟基喜树碱和葡萄糖醛酸化SN-38，标准曲线血浆样本中各药物浓度范围如下：伊立替康：2.5-625ng/mL；7-乙基-10-羟基喜树碱：0.5-120ng/mL；葡萄糖醛酸化SN-38：1.0-250ng/mL；标准曲线血浆样本中内标伏立康唑浓度为5.0ng/mL。 3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)中求得第二标准曲线的方法如下：取空白血浆，加入药物的甲醇水溶液和内标溴尿嘧啶的甲醇水溶液，分别制得各种药物一系列浓度的标准曲线血浆样本；采用5倍体积的体积比为：乙酸乙酯：异丙醇＝85:15的溶液对其中待测成分进行提取，取上清用氮气吹干后，再用体积分数5％的甲醇水溶液和二氯甲烷复溶；离心取上清在高效液相色谱质谱联用仪上进样分析，记录标准曲线血浆样本的色谱图，计算药物峰面积和内标峰面积的比值，然后以药物浓度为横坐标，以药物峰面积和内标峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，求得回归方程即为第二标准曲线；其中，所述药物是氟尿嘧啶及其代谢酶活性相关内源性物质尿嘧啶和二氢尿嘧啶，所述标准曲线血浆样本中各药物浓度范围如下：氟尿嘧啶10-1000ng/mL；尿嘧啶5-500ng/mL；二氢尿嘧啶10-1000ng/mL；标准曲线血浆样本中内标溴尿嘧啶浓度为330ng/mL。 4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)中加入3倍体积的含甲酸体积分数0.1％的甲醇沉淀；步骤(3)中加入5倍体积比为：乙酸乙酯：异丙醇＝85:15的溶液沉淀。 5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(4)中，色谱柱长度为100mm，内径为3mm，填料粒径为3μm。 6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述血浆为人的血浆。 7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述方法还包括方法学评价，评价内容为：线性、灵敏度、精密度、准确度、回收率、基质效应和稳定性。
所属类别：	发明专利