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原文传递基于单量子点的纳米传感器检测人烷基糖基化酶的方法

专利名称：	基于单量子点的纳米传感器检测人烷基糖基化酶的方法
摘要：	本公开提供了基于单量子点的纳米传感器检测人烷基糖基化酶的方法，hAAG引发发夹探针裂解产生触发探针，触发探针与AP探针杂交，在APE1酶的作用产生裂解释放出触发探针，并获得引物，释放的触发探针继续与AP探针杂交APE1的辅助下形成循环裂解，从而获得大量引物，获得引物与捕获探针杂交后，通过聚合将改性脱氧核糖核苷三磷酸聚合至双链DNA中，双链DNA通过生物素与单量子点的链霉亲和素的结合，使双链DNA自组装至单量子点的表面，然后经过激发后使Cy5产生荧光共振能量转移，并通过荧光显微镜测量。本公开提供的方法能够实现对hAAG的超灵敏检测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山东;37
申请人：	山东师范大学
发明人：	张春阳;李琛琛;刘万鑫;胡娟
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-15T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-26T00:00:00+0800
申请号：	CN201910199129.2
公开号：	CN110057793A
代理机构：	济南圣达知识产权代理有限公司
代理人：	王磊
分类号：	G01N21/64(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	250014 山东省济南市历下区文化东路88号
主权项：	1.一种基于单量子点的纳米传感器，其特征是，包括发夹探针、AP探针、捕获探针、改性单量子点、APE1酶、改性脱氧核糖核苷三磷酸；所述发夹探针为茎-环结构的单链DNA，茎结构的一条互补链修饰次黄嘌呤，茎结构中次黄嘌呤至末端序列为能够与AP探针配对杂交的触发探针；所述AP探针为含有AP位点的单链DNA，所述AP位点位于能够与触发探针互补的AP探针的序列中，AP位点至AP探针末端的序列为能够与捕获探针配对杂交的引物；所述捕获探针为一个末端修饰有生物素的单链DNA，捕获探针长度高于引物的长度，所述捕获探针分为两部分序列，一部分序列为能够与引物配对杂交的序列，另一部分序列中含有若干能够与改性脱氧核糖核苷三磷酸的位点，生物素修饰在另一部分序列的末端；所述改性脱氧核糖核苷三磷酸为修饰有Cy5的一种脱氧核糖核苷三磷酸；所述改性单量子点为表面修饰链霉亲和素的单量子点。 2.如权利要求1所述的纳米传感器，其特征是，所述发夹探针为3'端突出的茎-环结构的单链DNA，次黄嘌呤位于茎结构的3'端的互补链上，所述触发探针为次黄嘌呤至3'端的序列。 3.如权利要求1所述的纳米传感器，其特征是，所述AP探针的长度大于触发探针的长度；或，所述引物为AP位点至AP探针5'端的序列。 4.如权利要求1所述的纳米传感器，其特征是，所述捕获探针的5'端修饰有生物素。 5.如权利要求1所述的纳米传感器，其特征是，发夹探针5'至3'的序列为CAC GAT GAATCC TAG ACT ATT TTT ATA GTC TAG GAT TCI TCG TGA CAA TAC AAC； AP探针5'至3'的序列为CGC TGG AGC TGA GTT GTT GTA TXG TCA CGA；捕获探针5'至3'的序列为AAA TGA CAT CGA CTG ACG TAC CTC A TAC AAC AACTCAGCT CCA GCG。 6.一种人烷基糖基化酶的检测试剂盒，其特征是，包括权利要求1～5任一所述的纳米传感器、缓冲溶液、DNA聚合酶；优选的，DNA聚合酶为Klenow片段聚合酶。 7.基于单量子点的纳米传感器检测人烷基糖基化酶的方法，其特征是，提供权利要求1～5任一所述的纳米传感器或权利要求6所述的检测试剂盒，hAAG引发发夹探针裂解产生触发探针，触发探针与AP探针杂交，在APE1酶的作用产生裂解释放出触发探针，并获得引物，释放的触发探针继续与AP探针杂交APE1的辅助下形成循环裂解，从而获得大量引物，获得引物与捕获探针杂交后，通过聚合将改性脱氧核糖核苷三磷酸聚合至双链DNA中，双链DNA通过生物素与单量子点的链霉亲和素的结合，使双链DNA自组装至单量子点的表面，然后经过激发后使Cy5产生荧光共振能量转移，并进行荧光检测。 8.如权利要求7所述的方法，其特征是，其步骤为： (1)将待测样品、发夹探针、APE1酶加入至1×NEBuffer 4中，在人体温度下进行反应； (2)向步骤(1)反应后的溶液中添加AP探针和APE1酶，在人体温度下进行反应； (3)将步骤(2)反应后的产物、捕获探针、改性脱氧核糖核苷三磷酸、与改性脱氧核糖核苷三磷酸不同另外三种脱氧核糖核苷三磷酸、Klenow片段聚合酶添加至1×NEBuffer2中，在人体温度下进行反应； (4)将步骤(3)反应后的产物、改性单量子点加入至含有氯化镁、Tris-HCl和硫酸铵的溶液中进行孵育获得QD-dsDNA-Cy5纳米结构； (5)将获得的QD-dsDNA-Cy5纳米结构进行荧光检测。 9.如权利要求7所述的方法，其特征是，荧光检测条件为：激发波长为405nm，激发和发射狭缝均为5nm。 10.如权利要求7所述的方法，其特征是，将发夹探针放入孵育缓冲溶液中，升温至90～100℃进行孵育，然后冷却至室温形成发夹结构；所述孵育缓冲溶液中含有氯化镁和Tris-HCl。
所属类别：	发明专利