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原文传递一种基于适配体的现场快速检测黄曲霉毒素B1的方法

专利名称：	一种基于适配体的现场快速检测黄曲霉毒素B1的方法
摘要：	本发明公开了一种基于适配体的现场快速检测黄曲霉毒素B1的方法，属于分析化学及生物技术领域。该方法包括Helper修饰磁珠、AFTB1和AFTB1适配体混合物的制备、DNA的杂交、滚环扩增反应四个步骤。利用磁珠在外磁场作用下易于收集和分离的优点，以及生物素与链霉亲和素之间专一、迅速和稳定结合的特点，将生物素修饰的辅助DNA连接在链霉亲和素磁珠上，后加入到AFTB1和足量AFTB1适配体的混合物中，当AFTB1存在时，通过滚环扩增反应，反应液显蓝色，从而实现对AFTB1黄曲霉毒素B1的快速可视化检测。
专利类型：	发明专利
申请人：	福建中医药大学
发明人：	张红艳;魏小红;余宇燕
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T22:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T08:00:00+0805
申请号：	CN202010073461.7
公开号：	CN111122847A
代理机构：	福州元创专利商标代理有限公司
代理人：	饶文君;蔡学俊
分类号：	G01N33/53;C12Q1/6844;G;C;G01;C12;G01N;C12Q;G01N33;C12Q1;G01N33/53;C12Q1/6844
申请人地址：	350108 福建省福州市闽侯县上街镇邱阳路1号
主权项：	1.一种基于适配体的现场快速检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：（1）Helper修饰磁珠：取2 µL 10 mg/mL链霉亲和素磁珠于1.5 mL的EP管中，加50µL 1xB&W清洗液混匀，借助外加磁场的作用，将上清液吸走，重复洗3次；最后加20 µL PBS-T缓冲液重悬，制成浓度为1 mg/mL的链霉亲和素磁珠，室温放置备用；取2 µL 1 mg/mL 制备好的链霉亲和素磁珠于1.5 mL的EP管中，再加入20 µL 0.1 µM 辅助DNA Helper，25℃孵育40min后，用100 µL PBS-T缓冲液清洗3次，清洗去多余的未结合上的Helper，获得Helper修饰磁珠；（2）AFTB1和AFTB1适配体混合物的制备：先往1.5 mL的EP管中各加入20 µL 0.1 µMAFTB1适配体，再加入5µL一定浓度的AFTB1溶液，25℃孵育1 h，得到AFTB1和AFTB1适配体混合物；（3）DNA的杂交：将（2）中得到的AFTB1和AFTB1适配体混合物转移到（1）的Helper修饰磁珠EP管中，再加入25 µL PBS-T缓冲液，在25℃孵育1 h，用100 µL PBS-T缓冲液清洗3次；（4）滚环扩增反应：往步骤（3）的EP管中加入5µL 2x Quick Ligation Buffer和4 µL 1µM 环形DNA，25℃孵育30min后，加入 1 µL 350 U/µL 的T4 DNA连接酶，25℃孵育5 min，借助外磁场的作用力，用100 µL PBS-T缓冲液清洗3次；再加入2 µL10x Phi 29 Buffer，2 µL10 mM 的 dNTP，14.5 µL超纯水，0.5 µL 100x BSA和1 µL 10 U/µL Phi 29 DNA聚合酶，30℃孵育3 h；借助外磁场的作用力，用100 µL PBS-T缓冲液清洗3次，再加入24 µL PBS-T和2.5 µL 100 µM 信号DNA，25℃孵育30 min后，借助外磁场的作用力，用100 µL PBS-T缓冲液清洗3次，再加48µL PBS-T缓冲液，2µL 0.02 mg/mL辣根过氧化物酶，25℃孵育30 min后，借助外磁场的作用力，用200 µL PBS-T缓冲液清洗5次，再加入200 µL TMB/H2O2显色底液进行显色观察。 2.根据权利要求1所述的一种基于适配体的现场快速检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于：步骤（1）中所述Helper的核苷酸序列为：5′-ACACGTGCCCAACTTTTTT- biotin - 3′。 3.根据权利要求1所述的一种基于适配体的现场快速检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于：步骤（2）中所述AFTB1适配体的核苷酸序列为：5′- GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC- biotin - 3′。 4.根据权利要求1所述的一种基于适配体的现场快速检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于：步骤（2）中所述AFTB1溶液的浓度为：0~100µM。 5.根据权利要求1所述的一种基于适配体的现场快速检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于：步骤（4）中所述环形DNA 的序列为：5'-PO4-CACGTGTTCATATAAGTTGGTACCGCAGTATGAGTATCTCCTATGAGTACTAAGTGGAAGAAATCATGG-3′；所述信号DNA的序列为：5′-AAGTGGAAGAAAT- biotin - 3′。 6.根据权利要求1所述的一种基于适配体的现场快速检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于：所述方法中所述 B&W清洗液的组成为：5 mM Tris-HCl，0.5 mM EDTA，1 M NaCl，0.05 % Tween-20；所述PBS-T缓冲液的组成为：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，0.05 % Tween-20。
所属类别：	发明专利