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原文传递磁珠评价免疫检查点分子阻断性抗体阻断活性方法

专利名称：	磁珠评价免疫检查点分子阻断性抗体阻断活性方法
摘要：	本发明属于免疫学检测领域，具体涉及磁珠评价免疫检查点分子阻断性抗体阻断活性方法。本发明利用固相有抗标签分子抗体的磁珠与表达标签分子(标签一)的免疫检查点分子蛋白固相到磁珠表面，该磁珠可与带有另外一标签分子(标签二)的免疫检查点分子的配体发生特异性结合，再利用生光物质(荧光或可见光)标记的标签二特异结合抗体对磁珠表面免疫检查点分子蛋白/配体分子蛋白复合物进行定量检测。当免疫检查点分子的阻断性抗体与固相有免疫检查点分子蛋白的磁珠及配体蛋白共存时，抗体的阻断活性与最终磁珠发光强度成反比，从而通过光强度检测实现对抗体阻断活性的定量分析。本磁珠方法操作简单，反应迅速，经济节约，节省时间。
专利类型：	发明专利
申请人：	山西大学
发明人：	孟庆来;傅羽佳;李沈芝;吴长新
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T03:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T19:00:00+0805
申请号：	CN202010005802.7
公开号：	CN111175489A
代理机构：	太原申立德知识产权代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：	郭海燕
分类号：	G01N33/543;G;G01;G01N;G01N33;G01N33/543
申请人地址：	030006 山西省太原市坞城路92号
主权项：	1.磁珠评价免疫检查点分子阻断性抗体阻断活性方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1，复苏磁珠：将磁珠容器中的磁珠与液相混合均匀振荡器涡旋剧烈震荡30秒，构成磁珠悬液；步骤2，取1uL磁珠悬液放置于1.5mL微量离心管管底，然后加入1mL pH值为7.4含有1mg/mL BSA的0.01M PBS混合均匀，将微量离心管放在磁力架上吸附磁珠2min，取出清液，保留磁珠；步骤3，向步骤(2)保留磁珠的微量离心管中加入50uL pH值为7.4含有1mg/mL BSA的0.01M PBS缓冲液BSA-PBS和0.25ug免疫检查点分子重组蛋白溶液，混匀后冰浴30min，每隔10min吹匀一次，冰浴完成后，再加入1mL BSA-PBS缓冲液混合均匀，将微量离心管放在磁力架上吸附磁珠2min，取出清液，保留磁珠；步骤4，向步骤(3)保留磁珠的微量离心管中加入1mL BSA-PBS缓冲液混和均匀，然后取1uL放置于新的1.5mL微量离心管管底，此时加入不同浓度的阻断性抗体或阻断性抗体的同型对照抗体至终体积为30uL的混合物，室温下放置10min；步骤5，将步骤(4)中的混合物平均分为两份，15uL/份，一份加入5uL与步骤3中所述免疫检查点分子重组蛋白相对应的免疫检查点分子配体蛋白，胞外部分与人IgG Fc部分融合表达的重组蛋白“免疫检查点分子配体-Fc重组蛋白”称为配体-Fc融合蛋白，即为配体-Fc融合蛋白组；另一份加入5ul的人IgG，最终反应体系体积为20uL，配体-Fc融合蛋白和人IgG终浓度均为1ug/mL，阻断性抗体及阻断性抗体的同型对照抗体终浓度为1ug/mL、0.5ug/mL、0.25ug/mL、0.125ug/mL、0.0625ug/mL、0.0312ug/mL、0.0156ug/mL及0ug/mL，室温下放置20min，即为人IgG组；步骤6，向步骤(5)处理后的人IgG组和配体-Fc融合蛋白组中分别加入1mL BSA-PBS缓冲液混合均匀，将微量离心管放在磁力架上吸附磁珠2min，取出清液，保留磁珠；再在微量离心管内加入1mL BSA-PBS缓冲液重新清洗磁珠一遍，吸弃上清液；步骤7，在步骤(6)处理后的人IgG组和配体-Fc融合蛋白组中分别加入90uL BSA-PBS缓冲液混合均匀，再加入“生光物质”标记的抗人IgG-Fc抗体，冰浴30min；步骤8，生光物质的下游检测实验及抗体阻断效率计算。 2.根据权利要求1所述的磁珠评价免疫检查点分子阻断性抗体阻断活性方法，其特征在于：所述步骤(1)中的磁珠上固相有一号标签，步骤(3)免疫检查点重组蛋白溶液中的免疫检查点重组蛋白上带有二号标签，一号标签与二号标签可以发生特异性结合，应匹配使用；所述一号标签为抗多聚组氨酸标签His-tag的抗体，相匹配的二号标签为6个连续组氨酸组成的多聚组氨酸标签His-tag；所述一号标签为亲和素Avidin或是链霉亲和素Streptavidin或者是抗生物素蛋白，相匹配的二号标签为生物素化的、由15个氨基酸GLNDIFEAQKIEWHE组成的AviTag标签；所述一号标签为抗Flag标签的抗体，相匹配的二号标签为由8个氨基酸DYKDDDDK组成的Flag标签蛋白；所述一号标签为抗c-Myc标签的抗体，相匹配的二号标签为由11个氨基酸EQKLISEEDL组成的c-Myc标签；所述一号标签为抗HA标签的抗体，相匹配的二号标签为由9个氨基酸YPYDVPDYA组成的HA标签。 3.根据权利要求1所述的磁珠评价免疫检查点分子阻断性抗体阻断活性方法，其特征在于：所述步骤(3)中免疫检查点分子重组蛋白溶液包括但不局限于表1中所列免疫检查点分子中任意一种；所述步骤(5)中配体蛋白包括但不局限于表1中所列配体分子中任意一种；免疫检查点分子及与其进行配对使用的配体分子列于表1，表1 4.根据权利要求1所述的磁珠评价免疫检查点分子阻断性抗体阻断活性方法，其特征在于：所述步骤7中生光物质分为三种：第一种为荧光染料、荧光蛋白、荧光蛋白/荧光染料合成物或量子点；第二种为萤火虫荧光素酶；第三种为底物是TMB的辣根过氧化物酶HRP或底物为pNNP的碱性磷酸酶ALP。 5.根据权利要求4所述的磁珠评价免疫检查点分子阻断性抗体阻断活性方法，其特征在于：所述生光物质为荧光染料、荧光蛋白、荧光蛋白/荧光染料合成物或量子点，具体见表2，表2 6.根据权利要求1所述的磁珠评价免疫检查点分子阻断性抗体阻断活性方法，其特征在于：所述步骤8生光物质的下游检测实验及抗体阻断效率计算的具体方法为：生光物质的下游检测实验及抗体阻断效率计算方法根据生光物质的不同分为三种：第一种，生光物质为荧光染料、荧光蛋白、荧光蛋白/荧光染料合成物或量子点时，生光物质的下游检测实验及抗体阻断效率计算方法为：对权利要求1中步骤(7)处理后的人IgG组和配体-Fc融合蛋白组中分别加入1mL BSA-PBS缓冲液混合均匀，将微量离心管放在磁力架上吸附磁珠，吸弃上清液，保留磁珠；管内加入1mL BSA-PBS盐缓冲液重新清洗磁珠一遍，吸弃上清液；对处理后的人IgG组和配体-Fc融合蛋白组中的磁珠中分别加入200uL BSA-PBS缓冲液混合均匀，并转移到流式管中，用流式细胞仪检测；流式细胞仪检测方法：对于流式细胞术分析抗体活性的实验，以人IgG处理样品做为荧光阴性染色磁珠对照，在流式数据分析时以以荧光阴性染色磁珠群为参考画出分析荧光阳性染色磁珠群的门以定量分析荧光阳性染色磁珠群；以阻断性抗体的同型对照抗体处理样品作为免疫检查点蛋白分子可与配体-Fc重组蛋白发生结合的为最高结合水平，并将最高结合水平最为阳性对照分析阻断性抗体的相对阻断效率；待测抗体的阻断效率的计算公式为：抗体阻断效率＝(1–抗体处理样品荧光阳性磁珠百分率/抗体同型对照抗体处理样品荧光阳性磁珠百分率)x 100％；第二种，生光物质为萤火虫荧光素酶，生光物质的下游检测实验及抗体阻断效率计算方法为：对权利要求1中步骤(7)处理后的人IgG组和配体-Fc融合蛋白组中分别加入1mL BSA-PBS缓冲液混合均匀，将微量离心管放在磁力架上吸附磁珠，吸弃上清液，保留磁珠；管内加入1mL BSA-PBS盐缓冲液重新清洗磁珠一遍，吸弃上清液；对处理后的人IgG组和配体-Fc融合蛋白组中的磁珠加入50uL pH为7.4含有1mg/mLBSA、1mM CaCl2及0.5mM MgCl2的杜氏磷酸盐缓冲液D-PBS重悬磁珠，并把磁珠悬液转移到白色96孔板孔中，后向磁珠悬液中加入50uL Britelite plus荧光素底物液并混匀，室温下放置5min后，用荧光素读板机进行读板检测；荧光素读板机进行读板检测方法：对于荧光素读板机分析抗体活性的实验，以人IgG处理样品为荧光背景阴性对照；以阻断性抗体的同型对照抗体处理样品作为免疫检查点蛋白分子可与配体-Fc重组蛋白发生结合的为最高结合水平，并将最高结合水平最为阳性对照分析阻断性抗体的相对阻断效率；待测抗体的阻断效率的计算公式为：抗体阻断效率＝(1–(抗体处理样品荧光读数-IgG处理样品荧光背景)/(抗体同型对照抗体处理样品荧光读数-IgG处理样品荧光背景))x100％；第三种，生光物质为辣根过氧化物酶HRP或碱性磷酸酶ALP，生光物质的下游检测实验及抗体阻断效率计算方法为：在权利要求1中步骤(7)处理后的人IgG组和配体-Fc融合蛋白组中分别加入1mL BSA-PBS缓冲液混合均匀，将微量离心管放在磁力架上吸附磁珠，吸弃上清液，保留磁珠；管内加入1mL BSA-PBS盐缓冲液重新清洗磁珠一遍，吸弃上清液；对处理后的人IgG组和配体-Fc融合蛋白组中的磁珠加入100uL对于HRP为生光物质的TMB底物液或对于ALP为生光物质的PNPP底物液，重悬磁珠，并把磁珠液转入普通96孔酶标板孔中，室温下放置15min，向反应孔中加入100uL 2M H2SO4或100uL 0.75M NaOH对反应进行终止；把酶标板放入酶标仪中进行读板检测；酶标仪读板检测方法：对于酶标仪分析抗体活性的实验，以人IgG处理样品为可见光背景阴性对照；以阻断性抗体的同型对照抗体处理样品作为免疫检查点蛋白分子可与配体-Fc重组蛋白发生结合的为最高结合水平，并将最高结合水平最为阳性对照分析阻断性抗体的相对阻断效率；待测抗体的阻断效率的计算公式为：抗体阻断效率＝(1–(抗体处理样品光读数-IgG处理样品光读数)/(抗体同型对照抗体处理样品光读数-IgG处理样品光读数))x 100％。
所属类别：	发明专利