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原文传递一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针及其制备方法

专利名称：	一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针及其制备方法
摘要：	本发明将拉曼的特点与精确检测的探针首次通过特定的方法结合起来，制备出了靶向检测胶原蛋白的拉曼探针Cys‑Ahx‑(Gly‑Pro‑Hyp)7‑Ag纳米粒子‑4‑MBN和Cys‑Ahx‑LRELHLNNNG‑Ag纳米粒子‑R1，所述R1和4‑MBN为信号分子，其中R1为硫代乙酸S‑(4‑三甲基硅烷基乙炔基‑苯基)酯；本发明还提供了多肽拉曼探针的制备方法：通过固相合成胶原蛋白靶向多肽，再将信号分子和胶原蛋白靶向多肽同时修饰到Ag纳米粒子上。本发明提供的多肽拉曼探针，具有显著增强的拉曼信号，并且对胶原蛋白具有高特异性的结合能力，制备简单、检测方便，可用于体外和体内组织成像，为胶原蛋白相关疾病的研究提供了一种有潜力的检测工具。
专利类型：	发明专利
申请人：	兰州大学
发明人：	肖建喜;粘琳格
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T11:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T19:00:00+0805
申请号：	CN202010166940.3
公开号：	CN111175283A
代理机构：	北京力量专利代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：	韩慧颖
分类号：	G01N21/65;G;G01;G01N;G01N21;G01N21/65
申请人地址：	730000 甘肃省兰州市城关区天水南路222号
主权项：	1.一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针，其特征在于，其包含一个可以靶向结合胶原蛋白的多肽序列；探针的N端为半胱氨酸，帮助探针结合到具有拉曼增强能力的纳米粒子上；半胱氨酸与胶原蛋白靶向序列之间通过一个小片段连接，以避免纳米粒子干扰多肽序列靶向结合胶原蛋白；具有拉曼增强能力的纳米粒子上同时修饰拉曼信号分子，提供拉曼检测信号。 2.一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针的制备方法，其特征在于，为以下步骤：1)固相合成特定序列的胶原蛋白靶向多肽；2)将信号分子修饰到具有拉曼增强能力的纳米粒子上；3)将多肽结合到已被信号分子修饰的纳米粒子上。 3.一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针的成像方法，其特征在于，体外组织成像方法为，使用多肽拉曼探针溶液对组织切片进行染色，在2-6℃孵育1-4hrs，吸去染色液后，1×PBS洗掉未结合的拉曼探针，使用拉曼显微镜进行成像；体内活体成像方法为，将多肽拉曼探针注射入实验活体内，然后麻醉后放入成像装置中进行成像试验。 4.根据权利要求1所述的一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针，其特征在于：多肽拉曼探针的结构为Cys-Linker-X-Y-Z，其中，Cys为半胱氨酸，X为包含4-46个氨基酸的胶原蛋白靶向多肽，Linker为连接半胱氨酸和胶原蛋白靶向多肽的小片段；Y为具有拉曼增强能力的纳米粒子，Z为拉曼信号分子，X和Z均修饰在Y表面；连接半胱氨酸与胶原蛋白靶向序列的小片段为6-氨基己酸、聚乙二醇、1-10个甘氨酸、聚乙烯中的至少一种；具有拉曼增强能力的纳米粒子为过渡金属纳米粒子和半导体纳米基底及纳米粒子负载到三维结构物质上形成的SERS复合基底中的至少一种；信号分子为4-MBA、4-MBN、4-EBT、4-三甲基硅基乙炔-苯硫酚、4-苯基乙炔基-苯硫酚、硫代乙酸S-(4-三甲基硅烷基乙炔基-苯基)酯中的至少一种。 5.根据权利要求2所述的一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针的制备方法，其特征在于，固相合成特定序列的胶原蛋白靶向多肽的方法为： a)将80-120mg的树脂加入具有筛板的反应器中，使用2-8mL二氯甲烷溶胀树脂； b)由15-25％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除N端Fmoc保护基，通过显色反应来检测保护基的脱除程度； c)将N端由Fmoc保护的氨基酸与HOBt和HBTU由DMF溶解，低温活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA，溶液混合均匀后加入到反应器中，反应1-6hrs，氨基酸、HOBt、HBTU与DIEA的摩尔比为4:4：4:6； d)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由2-8mLDMF和DCM洗2-4次，显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由15-25％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min，树脂分别由5mL的DMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全； e)之后重复步骤c)和d)，直到合成目标序列的胶原多肽后，显色反应检测反应完全后，树脂分别由3-8mLDMF和DCM洗2-4次； f)树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤2-4次，然后将树脂抽干，加入切割液，切割液的组分为TFA:TIS:水的质量比为90:5:5，反应1-6hrs； g)向反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀，然后通过离心收集沉淀，用TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2-4次后干燥，得到粗肽，粗肽由反相液相色谱纯化得纯肽。 6.根据权利要求2所述的一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针的制备方法，其特征在于，将信号分子修饰到具有拉曼增强能力的纳米粒子上的具体方法为，该信号分子通过巯基或氨基修饰到纳米粒子表面，首先将信号分子溶于DMSO配成100mM的溶液，取1mL纳米粒子与100uL信号分子溶液混合搅拌1-4hrs，使巯基配位到纳米粒子表面，然后12000rmp离心洗去多余信号分子，得到信号分子修饰的纳米粒子。 7.根据权利要求2所述的一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针的制备方法，其特征在于，将多肽结合到已被信号分子修饰的纳米粒子上的具体方法为：多肽通过N-端的半胱氨酸配位作用修饰到纳米粒子上，将多肽溶于水中配成2mM的溶液，取200uL修饰了信号分子的纳米粒子与400uL多肽溶液混合搅拌1-4hrs，确保半胱氨酸上的巯基配位到纳米离子表面，保证了多肽的成功修饰，然后12000rmp离心洗去多余多肽，得到多肽修饰的拉曼探针。 8.根据权利要求3所述的一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针的成像方法，其特征在于：组织切片为冰冻切片或石蜡切片；在组织切片使用80-120μL多肽拉曼探针溶液染色，在2-6℃孵育1-4hrs，使用1×PBS洗掉未结合探针，使用拉曼显微镜观察拍照。 9.根据权利要求3所述的一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针的成像方法，其特征在于：组织切片为模型动物组织切片和病理组织切片，病理组织切片为良性肿瘤组织、恶性肿瘤组织、骨科组织疾病、纤维化组织、炎症组织、增生组织、动脉粥样硬化组织、肝硬化组织、眼睛激光矫正手术术后组织、皮肤光损伤组织、皮肤热损伤组织、皮肤酸碱腐蚀组织或辐射损伤组织。 10.根据权利要求3所述的一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针的成像方法，其特征在于：胶原多肽拉曼探针在注射前先溶于已灭菌的含半胱氨酸的1×PBS中，实验活体为模型动物。
所属类别：	发明专利