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原文传递一种靶向识别变性胶原蛋白的多肽探针及其检测方法

专利名称：	一种靶向识别变性胶原蛋白的多肽探针及其检测方法
摘要：	本发明公开了一种靶向识别变性胶原蛋白的多肽探针及其检测方法。其包括：(1)多肽探针的设计：新型的多肽探针，特征包括:①、多肽序列中间含有较多的(Hyp‑Hyp‑Gly)n重复序列；②、多肽序列的特定位置修饰发光物质；(2)多肽探针的制备：固相合成特定序列的多肽，再将发光物质修饰到该多肽；(3)体外组织成像；(4)体内成像。本发明设计的一种新型多肽探针，对变性的胶原蛋白具有良好的结合能力，生物相容性好，特异性强，而且合成工艺简单，操作流程方便。该探针为癌症，心血管疾病和器官纤维化等重要疾病的分子水平的诊断，提供了一种新的有潜力的检测方法。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	甘肃;62
申请人：	兰州大学
发明人：	肖建喜;魏文宇
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-11T00:00:00+0800
发布日期：	2019-10-15T00:00:00+0800
申请号：	CN201910179342.7
公开号：	CN110333354A
代理机构：	北京轻创知识产权代理有限公司
代理人：	王新生
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	730000 甘肃省兰州市城关区天水南路222号
主权项：	1.一种靶向识别变性胶原蛋白的多肽探针及其检测方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)多肽探针的设计新型的多肽探针，特征包括:①、多肽序列中间含有较多的(Hyp-Hyp-Gly)n重复序列；②、多肽序列的特定位置修饰发光物质； (2)多肽探针的制备固相合成特定序列的多肽，再将发光物质修饰到该多肽； (3)体外组织成像在组织切片上加封闭液，放置10-50min后吸走液体，使用探针溶液染色，在2-6℃孵育1-3hrs，吸去染色液后，使用DAPI稀释液染色，使用1xPBS洗掉未结合探针和过量DAPI稀释液，滴封固液，加盖玻片，使用荧光显微镜观察拍照； (4)体内成像将胶原多肽探针注射入实验活体内，然后麻醉后放入成像装置中进行成像试验。 2.根据权利要求1所述的一种靶向识别变性胶原蛋白的多肽探针及其检测方法，其特征在于：所述多肽探针的序列为X-(Gly)m-(Hyp-Hyp-Gly)n，m为0-8之间的整数,n为4-20之间的整数；其中X为发光物质，Gly为甘氨酸，Pro为脯氨酸，Hyp为羟脯氨酸。 3.根据权利要求1所述的一种靶向识别变性胶原蛋白的多肽探针及其检测方法，其特征在于：所述发光物质为荧光素类分子、香豆素类分子、罗丹明类分子、菁染料类分子、BODIPY类分子、方酸类分子、磷光分子、半导体量子点、碳量子点、硅量子点、硫量子点、磷量子点、钙钛矿量子点、上转化稀土纳米材料、长余辉纳米材料中的一种或几种。所述发光物质连接在胶原多肽的N端。 4.根据权利要求1所述的一种靶向识别变性胶原蛋白的多肽探针及其检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中多肽固相合成的具体方法为： a)将80-250mg的树脂加入具有筛板的反应器中，使用2-8mL二氯甲烷溶胀树脂； b)由15-25％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除N端Fmoc保护基，通过显色反应来检测保护基的脱除程度； c)将N端由Fmoc保护的氨基酸4eq与HOBt4eq和HBTU4eq由DMF溶解，低温活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA6eq，溶液混合均匀后加入到反应器中，反应1-6hrs； d)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由2-8mLDMF和DCM洗2-4次，显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由15-25％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min，树脂分别由5mLDMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全； e)之后重复步骤c)和d)，直到合成目标序列的多肽。显色反应检测反应完全后，树脂分别由3-8mLDMF和DCM洗2-4次； f)称取发光物质4eq、HOBt4eq和HBTU4eq，由DMF溶解，低温活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA4-10eq，混合液加入到多肽溶液中，避光反应12-48hrs； g)树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤2-5次，然后将树脂抽干，加入切割液，切割液的组分为TFA:TIS:水的质量比为95:2.5:2.5，反应1-6hrs； h)向反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀，然后通过离心收集沉淀，用TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2-4次后干燥，得到粗肽，粗肽由反相液相色谱纯化得纯肽。 5.根据权利要求1所述的一种靶向识别变性胶原蛋白的多肽探针及其检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中组织切片为冰冻切片或石蜡切片；在组织切片上加0.2-0.8mL封闭液，放置10-50min后吸走液体，使用80-120μL探针溶液染色，在2-6℃孵育1-3hrs，吸去染色液后，使用80-120μLDAPI稀释液染色0.5-1.5min，使用1xPBS洗掉未结合探针和过量DAPI稀释液，滴封固液，加盖玻片，使用荧光显微镜观察拍照。 6.根据权利要求1所述的一种靶向识别变性胶原蛋白的多肽探针及其检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中的组织切片，包括模型动物组织切片和病理组织切片。其中病理组织切片，可为良性肿瘤组织、恶性肿瘤组织、骨科组织疾病、纤维化组织、炎症组织、增生组织、动脉粥样硬化组织、肝硬化组织、眼睛激光矫正手术术后组织、皮肤光损伤组织、皮肤热损伤组织、皮肤酸碱腐蚀组织、辐射损伤组织等。 7.根据权利要求1所述的一种靶向识别变性胶原蛋白的多肽探针及其检测方法，其特征在于：所述步骤(4)中多肽探针在注射前先溶于已灭菌的含半胱氨酸的1XPBS中，实验活体包括小鼠、大鼠、斑马鱼、猴等各种模型动物。
所属类别：	发明专利