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原文传递利用多表位串联蛋白检测猪口蹄疫O型抗体的化学发光检测试剂盒

专利名称：	利用多表位串联蛋白检测猪口蹄疫O型抗体的化学发光检测试剂盒
摘要：	本发明涉及利用多表位串联蛋白检测猪口蹄疫O型抗体的化学发光检测试剂盒，属于生物技术领域，所述试剂盒包括包被有M2抗原的化学发光板、酶标二抗、血清稀释液、20×PBST洗涤液、阳性对照血清、阴性对照血清、化学发光底物A液和B液。所述M2抗原是能区分型的多表位串联蛋白，所述多表位串联蛋白是将O型口蹄疫3个拓扑型中不同分离株的鉴别型表位串联所得；所述鉴别型表位为G‑H环的140‑154位氨基酸。本发明所述的试剂盒灵敏度高、特异性好、广谱性好、与免疫A型和Asia 1型单价苗血清无交叉反应，并且操作简单，反应时间短，在口蹄疫O型抗体检测中具有很好的应用前景。
专利类型：	发明专利
申请人：	中国农业科学院兰州兽医研究所
发明人：	常惠芸;刘伟;邵军军;常艳燕
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T14:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T00:00:00+0805
申请号：	CN202010037597.2
公开号：	CN111208302A
代理机构：	洛阳公信知识产权事务所(普通合伙)
代理人：	时亚娟
分类号：	G01N33/68;G01N33/569;G01N21/76;G;G01;G01N;G01N33;G01N21;G01N33/68;G01N33/569;G01N21/76
申请人地址：	730000 甘肃省兰州市城关区盐场堡徐家坪1号
主权项：	1.利用多表位串联蛋白检测猪口蹄疫O型抗体的化学发光检测试剂盒，其特征在于：包括包被M2抗原的化学发光板、酶标二抗、血清稀释液、20×PBST洗涤液、阳性对照血清、阴性对照血清、化学发光底物A液和B液；所述M2抗原是能区分型的多表位串联蛋白，所述多表位串联蛋白是将O型口蹄疫3个拓扑型中不同分离株的鉴别型表位串联所得；所述鉴别型表位为G-H环的140-154位氨基酸。 2.根据权利要求1所述的利用多表位串联蛋白检测猪口蹄疫O型抗体的化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述多表位串联蛋白的制备方法，包括以下步骤：（1）、鉴别型表位的筛选：通过比对GenBank上FMDV分离株的氨基酸序列，选择不同血清型之间有差异的位点，然后设计引物，并通过退火形成分别编码各表位蛋白的双链DNA分子，再将其分别与已经用相同酶酶切的线性化质粒进行连接，得连接产物；然后将连接产物进行转化表达；经IPTG诱导表达后，做WB进行验证；将验证可用的蛋白进一步纯化后进行ELISA验证；（2）、鉴别型表位的串联：最终确定G-H环的140-154位氨基酸为O型口蹄疫的优势抗原表位；然后将口蹄疫O型3个拓扑型共6个分离株的所述优势抗原表位进行串联，所述6个分离株分别为：O/MYA 98/BY/2010, OS 99, O/SCGH/CHA/2016, Akesu/58、O/CHA/7/2011、O/XJBC/CHA/2017；然后构建重组表达质粒；（3）、多表位串联蛋白的表达与纯化：将步骤二所得重组表达质粒进行转化，经IPTG诱导表达后，将菌液离心、超声破碎，取上清进行纯化，得多表位串联蛋白产物。 3.根据权利要求2所述的利用多表位串联蛋白检测猪口蹄疫O型抗体的化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述多表位串联蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。 4.根据权利要求3所述的利用多表位串联蛋白检测猪口蹄疫O型抗体的化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述多表位串联蛋白的碱基序列为SEQ ID NO：1所示。 5.根据权利要求1-4任意一种所述的利用多表位串联蛋白检测猪口蹄疫O型抗体的化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述化学发光板是用碳酸盐缓冲液将纯化的M2抗原蛋白稀释为500 ng/ml，100 μl/孔加入到化学发光板中，4℃过夜包被；PBST洗3-4次后，向每孔中加入200 μl封闭液，于37℃封闭2 h；甩掉拍干后，室温干燥2h，装袋真空封闭，4℃保存。 6.根据权利要求5所述的利用多表位串联蛋白检测猪口蹄疫O型抗体的化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述的封闭液为含有体积分数为0.05% Tween-20、质量分数为5%蔗糖、质量分数为1% BSA和质量分数为0.1% proclin-300的PBS缓冲液。 7.根据权利要求1所述的利用多表位串联蛋白检测猪口蹄疫O型抗体的化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG抗体；所述血清稀释液为含有质量分数为1%酪蛋白、体积分数为0.05% Tween-20、质量分数为0.1% proclin-300、质量分数为2%蔗糖和体积分数为2%大肠杆菌裂解液的磷酸盐缓冲液；所述20×PBST为pH 7.2-7.4的浓度为0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，其中含有体积分数为1% 的Tween-20；所述化学发光A液含有0.1 mmol/L的鲁米诺和0.07 mol/L的发光增强剂IPP，化学发光B液为3mmol/L的H2O2溶液。 8.根据权利要求7所述的利用多表位串联蛋白检测猪口蹄疫O型抗体的化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述大肠杆菌裂解液的制备方法为：将pET-32a质粒转入大肠杆菌，37℃培养6 h，离心收集菌体；然后将菌体溶解于PBS中，在冰浴条件下超声20 min；然后离心，取上清，即为大肠杆菌裂解液。 9.根据权利要求1所述的利用多表位串联蛋白检测猪口蹄疫O型抗体的化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照血清是将口蹄疫O/Mya98/BY/2010单价灭活疫苗免疫猪3次收集的血清；所述阴性对照血清是未免疫过任何疫苗的健康猪血清。
所属类别：	发明专利