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原文传递纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法

专利名称：	纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法
摘要：	本发明公开纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法，包括如下步骤：(1)纳米酶的合成；(2)纳米酶‑诺如抗体探针的制备；(3)纳米酶免疫层析试纸条的组装；(4)纳米酶免疫层析试纸条对诺如病毒的检测。本申请的纳米酶免疫层析试纸条的检测的灵敏度比胶体金试纸条可提高10倍，纳米酶免疫层析试纸条对诺如病原体检测的敏感性高、可靠性高，且对诺如病毒具有特异性识别。本申请的纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法兼具胶体金技术的简便、快速、可现场应用的优点，又具有高灵敏度的特性，具有广阔的发展前景。
专利类型：	发明专利
申请人：	中国检验检疫科学研究院
发明人：	刘键;段德民;张永江
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T23:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T14:00:00+0805
申请号：	CN201911341144.2
公开号：	CN111007251A
代理机构：	北京冠榆知识产权代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：	朱亚琦
分类号：	G01N33/577;G01N33/569;G01N33/558;G;G01;G01N;G01N33;G01N33/577;G01N33/569;G01N33/558
申请人地址：	100176 北京市大兴区经济技术开发区荣华南路11号
主权项：	1.纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)纳米酶的合成； (2)纳米酶-诺如抗体探针的制备； (3)纳米酶免疫层析试纸条的组装； (4)纳米酶免疫层析试纸条对诺如病毒的检测。 2.根据权利要求1所述的纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法，其特征在于，在步骤(1)中，采用水热法合成纳米酶：将FeCl 3·6H2O溶解于乙二醇中，搅拌溶解，再加入醋酸钠，待混合物完全溶解后，密封于高压反应釜中，进行反应，得到的产物磁分离，弃上清，沉淀用乙醇清洗，然后用电热恒温干燥箱烘干保存，得到纳米酶。 3.根据权利要求2所述的纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法，其特征在于，在步骤(1)中，采用水热法合成纳米酶：将FeCl 3·6H2O溶解于乙二醇中，搅拌溶解，再加入一定量的醋酸钠，待混合物完全溶解后，密封于高压反应釜中，200℃反应14小时，得到的产物磁分离，弃上清，沉淀用乙醇清洗3次，然后用电热恒温干燥箱烘干保存，得到纳米酶。 4.根据权利要求1所述的的纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法，其特征在于，在步骤(2)中， (2-1)取步骤(1)中制备的纳米酶，用去离子水洗涤； (2-2)离心后，弃上清液；沉淀用MES缓冲溶液重悬，同时加入EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，混匀后，置于摇床内活化； (2-3)活化后，用MES缓冲溶液洗涤，然后用MES缓冲溶液重悬，得到活化的纳米酶； (2-4)诺如病毒鼠单克隆抗体与活化的纳米酶溶液过夜孵育； (2-5)加入Tris缓冲液，终止反应； (2-6)磁分离后，用5％BSA-Tris缓冲液重悬，即可得纳米酶-诺如抗体探针。 5.根据权利要求4所述的纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法，其特征在于，在步骤(2)中， (2-1)取步骤(1)中制备的纳米酶500μL，纳米酶的浓度为5mg/mL，用1mL去离子水洗涤三次； (2-2)离心后，弃上清液；沉淀用1mL的MES缓冲溶液重悬，MES缓冲溶液的pH为6.0，同时加入20μL的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和50μL的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，混匀后，置于摇床内活化30min；EDC的浓度为0.4mol/L，NHS的浓度为0.1mol/L；摇床的转速为70rpm； (2-3)活化后，用1mL的MES缓冲溶液洗涤一次，然后用500μL的MES缓冲溶液重悬，得到活化的纳米酶； (2-4)取50μg的诺如病毒鼠单克隆抗体与活化的纳米酶溶液过夜孵育，孵育温度为4℃； (2-5)用Tris缓冲液在室温下孵育30min，终止反应；Tris缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH为7.2； (2-6)磁分离后，用0.5mL的5％BSA-Tris缓冲液重悬，即可得纳米酶-诺如抗体探针。 6.根据权利要求1所述的的纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法，其特征在于，在步骤(3)中，包括如下步骤： (3-1)在硝酸纤维素膜(4)上划质控线C线和检测线T线：用浓度为1mg/mL的羊抗鼠抗体在硝酸纤维素膜上划线作为质控线；用浓度为2mg/mL的鼠源诺如单抗在硝酸纤维素膜上划线作为检测线，划线参数为0.1μL/mm，质控线和检测线之间的距离为7mm；划线后，将硝酸纤维素膜(4)置于恒温箱中干燥1h，干燥温度为40℃； (3-2)：在结合垫(3)上喷涂纳米酶-诺如抗体探针：将偶联好的纳米酶-诺如探针用1％BSA-Tris缓冲液稀释，配制得到纳米酶-诺如探针的浓度为1mg/mL；将稀释的纳米酶-诺如探针喷涂至结合垫(3)上，喷涂参数为0.5μL/mm；然后将结合垫(3)置于恒温箱中干燥1h，干燥温度为40℃； (3-3)：组装试纸条：将样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸收垫(5)依次贴在底卡(1)上，并且使硝酸纤维素膜(4)上的检测线靠近结合垫(3)，使硝酸纤维素膜(4)上的质控线靠近吸收垫(5)；样品垫(2)和结合垫(3)均为玻璃纤维膜，吸收垫(5)为吸水滤纸；组装成完整的纳米酶免疫层析试纸条，然后采用切条机切成宽度为4mm的试纸条； (3-4)在每一个纳米酶免疫层析试纸条上加盖上卡壳(6)，且卡壳(6)上开设有加样孔(6-1)和显色孔(6-2)；加样孔(6-2)盖在样品垫(2)上，显色孔(6-2)盖在硝酸纤维素膜(4)上，并且使质控线和检测线位于显色孔(6-2)内，完成纳米酶免疫层析试纸条的组装后，将组装好的纳米酶免疫层析试纸条置于密封袋中室温干燥保存。 7.根据权利要求1所述的纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法，其特征在于，在步骤(4)中，包括如下步骤： (4-1)取出纳米酶免疫层析试纸条，在加样孔(6-2)中加入100μL诺如抗原液，开始层析检测，计时10分钟；层析后，在纳米酶免疫层析试纸条的显色孔(6-2)内，加入1mL的纳米酶底物显色液，使纳米酶底物显色液的填满显色孔(6-2)，避光显色5-10分钟；纳米酶底物显色液为二氨基联苯胺DAB与双氧水； (4-2)避光显色5-10分钟时，用移液枪从加样孔(6-2)中吸走纳米酶底物显色液，然后观察纳米酶免疫层析试纸条上的质控线和检测线的颜色信号，判断检测结果，超过15分钟结果无效。 8.根据权利要求7所述的纳米酶试纸条检测诺如病毒的方法，其特征在于，判断检测结果的方法为：如果纳米酶免疫层析试纸条同时出现质控线和检测线，则检测结果为阳性，即待测样品中有诺如病毒；如果诺如病毒纳米酶免疫层析试纸条只出现质控线，检测结果为阴性，即待测样品中没有诺如病毒；如果诺如病毒纳米酶免疫层析试纸条只出现检测线，则检测结果无效，需重新检测。
所属类别：	发明专利