详情

原文传递一种液质联用测定人血浆中内源性1-磷酸鞘氨醇浓度的方法

专利名称：	一种液质联用测定人血浆中内源性1-磷酸鞘氨醇浓度的方法
摘要：	本发明目的在于提供一种可以准确测定人血浆中内源性1‑磷酸鞘氨醇(S1P)浓度的方法。本发明的方法突破了内源干扰检测的难点，并且具有专属性强、准确度和灵敏度较高的特性。本发明采用液质联用仪测定人血浆中内源性S1P的浓度，该方法包括：(1)替代基质的选择；(2)对照基质中内源性S1P浓度的确定；(3)工作曲线样品的制备及前处理；(4)质控样品的制备及前处理；(5)分离分析条件；(6)采用内标法，以系列S1P在替代基质中的浓度为横坐标，S1P与内标C17‑S1P的峰面积比为纵坐标，通过使用权重因子1/x2，线性回归得到理论浓度与响应之间的线性关系进行定量。
专利类型：	发明专利
申请人：	南京希麦迪医药科技有限公司
发明人：	李健;吴昱;周振东;奚成龙;闻常青
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T00:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T05:00:00+0805
申请号：	CN201911357053.8
公开号：	CN111103382A
代理机构：	连云港联创专利代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：	谷金颖
分类号：	G01N30/88;G01N30/86;G01N30/06;G01N30/72;G;G01;G01N;G01N30;G01N30/88;G01N30/86;G01N30/06;G01N30/72
申请人地址：	210000 江苏省南京市江宁区科学园芝兰路18号
主权项：	1.一种液质联用测定人血浆中内源性1-磷酸鞘氨醇浓度的方法，其特征在于，该方法包括： (1)替代基质的选择：选择5％BSA生理盐水溶液作为替代基质进行人血浆中1-磷酸鞘氨醇的方法学验证试验及样品分析试验； (2)人血浆中内源性1-磷酸鞘氨醇浓度的确定：用步骤(1)中所述的替代基质进行标准曲线样品的配制，然后对人血浆中的本底1-磷酸鞘氨醇的浓度进行测定，确定混合后的人血浆中1-磷酸鞘氨醇的平均浓度，用以计算实际质控样品的理论浓度； (3)标准曲线样品的制备及前处理：包括内标工作液的配制、标准系列溶液的配制、工作曲线样品的前处理，其中，内标工作液的配制为取C17-S1P标准品，用含2％HCl的DMSO溶液配制成浓度为250μg/mL的储备液；再用甲醇稀释成为20.0ng/mL的内标工作液；标准系列溶液的配制为取1-磷酸鞘氨醇标准品，用含2％HCl的DMSO溶液配制成浓度为250μg/mL的储备液，再用甲醇稀释成为200ng/mL、400ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、3000ng/mL、5000ng/mL、7200ng/mL和8000ng/mL的系列标准曲线工作液；工作曲线样品的前处理为向380μL的替代基质中分别加入20.0μL的上述用于标准曲线配制的系列标准曲线工作液，配制成相当于1-磷酸鞘氨醇在替代基质中的浓度为10.0ng/mL、20.0ng/mL、50.0ng/mL、1000ng/mL、150ng/mL、250ng/mL、360ng/mL和400ng/mL的样品，分装出2份，每份50.0μL；每份加入450μL的内标工作液进行蛋白沉淀，离心后取150μL上清液，加入等体积的50％甲醇水溶液，震荡离心后，供LC-MS/MS测定； (4)质控样品的制备及前处理：包括标准系列溶液的配制、质控样品的前处理，其中，标准系列溶液的配制为取1-磷酸鞘氨醇标准品，用含2％HCl的DMSO溶液配制成浓度为250μg/mL的储备液，再用甲醇稀释成为3980ng/mL的高浓度质控工作液；质控样品的前处理为向360μL人空白血浆中加入18.0μL相应浓度的高浓度质控工作液，配制320ng/mL的高浓度质控样品，以混合的人空白血浆样品作为137ng/mL的中浓度质控样品，取一定体积人空白血浆，再用替代基质稀释，配制65.0ng/mL的算数中浓度质控样品、25.0ng/mL的低浓度质控样品与10.0ng/m5L的定量下限质控样品，每个质控样品分装出6份，每份50.0μL，每份加入450μL内标工作液进行蛋白沉淀，离心后取150μL上清液，加入等体积的50％甲醇水溶液，震荡离心后，供LC-MS/MS测定； (5)采用内标法定量，以系列1-磷酸鞘氨醇在替代基质中的浓度为横坐标，1-磷酸鞘氨醇与内标C17-S1P的峰面积比为纵坐标，进行线性回归运算，权重因子为1/x2，得到线性回归方程，即为工作曲线，使用工作曲线，对人血浆中内源性1-磷酸鞘氨醇的浓度进行测定。 2.根据权利要求1所述的液质联用测定人血浆中内源性1-磷酸鞘氨醇浓度的方法，其特征在于，所述的LC-MS/MS测定条件为：液相色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C8 1.7μm(50x 2.1mm)；流动相：A＝0.4％的甲酸-水(10mmol/LNH4OAc)溶液；B＝0.4％甲酸-乙腈溶液，梯度如下： 0-0.50min，流动相A为60.0％，流动相B为40.0％；0.50-1.50min，流动相A从60.0％到10.0％，流动相B从40.0％到90.0％；1.50-2.10min，流动相A保持为10.0％，流动相B保持为90.0％；2.10-2.30min，流动相A从10.0％到60.0％，流动相B从90.0％到40.0％；2.30-3.00min，流动相A为60.0％，流动相B为40.0％；流速：0.500mL/min；柱温：40℃；进样量：1.00μL；质谱检测器及条件：离子源为电喷雾离子源；喷雾电压为-4500V；离子源温度：550℃；帘气：33psi，碰撞气：9psi，GS1：40psi，GS2：40psi；负离子方式检测；扫描方式：MRM；S1P定量离子对为378.3→79.0，碰撞电压为-30.0eV；内标C17-S1P定量离子对为364.3→79.1，碰撞电压为-34.0eV。 3.根据权利要求1所述的液质联用测定人血浆中内源性1-磷酸鞘氨醇浓度的方法，其特征在于，所述步骤(5)中的替代基质中1-磷酸鞘氨醇的工作曲线，优选的线性范围为10.0–400ng/mL，进一步优选的工作曲线为y＝0.005640x-0.001473，相关系数均大于0.9980。
所属类别：	发明专利