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原文传递一种生物标本中短链脂肪酸及其羟基化衍生物的检测方法

专利名称：	一种生物标本中短链脂肪酸及其羟基化衍生物的检测方法
摘要：	本发明提供一种生物标本中短链脂肪酸及其羟基化衍生物的检测方法，包括如下步骤：a)将生物标本分为组织标本和体液样本；将组织标本碱化后冻干、酸化、液液萃取，获得第一提取液；将体液样本采用乙腈沉淀蛋白后取上清液，获得第二提取液；b)将第一提取液和/或第二提取液浓缩、复溶后加入衍生化溶液进行化学衍生化，获得样品溶液；c)将样品溶液添加衍生化内标作为标记，采用气相色谱‑质谱联用法进行测定，确定样品溶液中短链脂肪酸及其羟基化衍生物的含量。本发明提供的一种生物标本中短链脂肪酸及其羟基化衍生物的检测方法，基于N‑甲基苄胺‑d0/d3的化学同位素标记策略，具有样本用量少、检测灵敏度高、适用范围广泛的优点。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	广东;44
申请人：	南方医科大学珠江医院
发明人：	周宏伟;夏方博;崔鹏
专利状态：	有效
申请日期：	2022-10-12T00:00:00+0800
发布日期：	2023-01-06T00:00:00+0800
申请号：	CN202211248427.4
公开号：	CN115575539A
代理机构：	上海光华专利事务所(普通合伙)
代理人：	许亦琳;余明伟
分类号：	G01N30/02;G01N30/04;G01N30/06;G01N30/72;G01N30/86;G;G01;G01N;G01N30;G01N30/02;G01N30/04;G01N30/06;G01N30/72;G01N30/86
申请人地址：	510280 广东省广州市工业大道中253号
主权项：	1.一种生物标本中短链脂肪酸及其羟基化衍生物的检测方法，包括如下步骤： a)将生物标本分为组织标本和体液样本；将组织标本碱化后冻干、酸化、液液萃取，获得第一提取液；将体液样本采用乙腈沉淀蛋白后取上清液，获得第二提取液； b)将第一提取液和/或第二提取液浓缩、复溶后加入含N-甲基苄胺-d0作为标记的衍生化溶液进行化学衍生化，获得样品溶液； c)将样品溶液添加含N-甲基苄胺-d3的衍生化内标作为标记，采用气相色谱-质谱联用法进行测定，确定样品溶液中短链脂肪酸及其羟基化衍生物的含量。 2.根据权利要求1所述的一种生物标本中短链脂肪酸及其羟基化衍生物的检测方法，其特征在于，所述短链脂肪酸及其羟基化衍生物选自甲酸、醋酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、2-甲基丁酸、乳酸、羟基乙酸、异戊酸、2-甲基戊酸、2-羟基丁酸、3-甲基戊酸、2-羟基-3-甲基丁酸、3-羟基丁酸、β-羟基异戊酸、己酸、2-羟基-2-甲基丁酸、2-羟基-4-甲基戊酸、正庚酸中的任一种或多种。 3.根据权利要求1所述的一种生物标本中短链脂肪酸及其羟基化衍生物的检测方法，其特征在于，步骤a)包括以下条件中的任一项或多项： A1)所述组织标本选自人或动物的粪便、脑组织、肠组织中一种或多种组合； A2)所述体液样本选自人或动物的血浆、尿液中一种或多种组合； A3)所述碱化是在组织标本中加入碱液，所述碱液为碳酸钠溶液； A4)所述冻干的时间为6-8h； A5)所述冻干的温度为-80--60℃： A6)所述酸化是在冻干后的组织标本中加入酸液，所述酸液为盐酸溶液； A7)所述液液萃取采用的萃取试剂为乙醚； A8)所述液液萃取中，所述组织标本加入的质量与萃取试剂加入的体积之比为40-60:50-150，mg/μL； A9)所述体液样本加入质量与乙腈加入体积之比为1:2-4，g/mL。 4.根据权利要求3述的一种生物标本中短链脂肪酸及其羟基化衍生物的检测方法，其特征在于，还包括以下条件中的任一项或多项： A31)在A3)中，所述碳酸钠溶液为碳酸钠的水溶液，所述碳酸钠溶液的浓度为40-60μg/mL； A32)在A3)中，所述组织标本加入质量与碱液加入体积之比为300-500:400-600，mg/μL； A61)在A6)中，所述盐酸溶液为浓度为4-6M盐酸水溶液； A62)在A6)中，所述组织标本加入的质量与酸液加入体积之比为40-60:205-415，mg/μL。 5.根据权利要求1所述的一种生物标本中短链脂肪酸及其羟基化衍生物的检测方法，其特征在于，步骤b)包括以下条件中的任一项或多项： B1)所述浓缩为吹氮蒸发至干； B2)所述复溶为将浓缩物溶解在无水乙腈中，所述无水乙腈的用量体积为90-110μL； B3)所述复溶液与衍生化溶液加入的体积比为40-60:100-200； B4)所述衍生化溶液包括有N-甲基苄胺-d0、HATU和三乙胺； B5)所述化学衍生化为将复溶液与衍生化溶液进行振荡反应。 6.根据权利要求1所述的一种生物标本中短链脂肪酸及其羟基化衍生物的检测方法，其特征在于，步骤c)包括以下条件中的任一项或多项： C1)所述样品溶液中添加衍生化内标的体积为5-15μL； C2)所述衍生化内标为短链脂肪酸及其羟基化衍生物的标准溶液与N-甲基苄胺-d3、HATU、三乙胺混合后振荡获得。 7.根据权利要求1所述的一种生物标本中短链脂肪酸及其羟基化衍生物的检测方法，其特征在于，步骤c)中，采用气相色谱-质谱联用法进行测定，包括以下步骤： 1)配制标准溶液：取短链脂肪酸及其羟基化衍生物的标准品，加入溶剂溶解后定容，配成标准溶液； 2)样品检测：采用气相色谱-质谱联用法分别检测添加衍生化内标作为标记的样品溶液和步骤1)中的标准溶液，比较保留时间进行定性，采用内标标准曲线法进行定量，确定样品溶液中短链脂肪酸及其羟基化衍生物的含量。 8.根据权利要求7所述的一种生物标本中短链脂肪酸及其羟基化衍生物的检测方法，其特征在于，步骤1)包括以下条件中的任一项或多项： D1)所述溶剂为乙腈； D2)所述标准溶液中短链脂肪酸及其羟基化衍生物的浓度范围为50-100μg/mL。 9.根据权利要求7所述的一种生物标本中短链脂肪酸及其羟基化衍生物的检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述气相色谱-质谱联用法中，所述气相色谱的测定条件为：色谱柱：CB毛细管色谱柱；进样口温度：270-290℃；进样量：0.5-2.0μL；载气：高纯氦气，载气纯度≥99.999％；载气流速：恒流流速，1.0-2.0ml/min；分流进样，分流比：1：10-20；升温程序：初始温度为90-110℃，保持1-3分钟，然后以30-50℃/min的速度升至130-150℃，保持15-25min，最后以5-15℃/min的速度增加到270-290℃，保持4-6min。 10.根据权利要求7所述的一种生物标本中短链脂肪酸及其羟基化衍生物的检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述气相色谱-质谱联用法中，所述质谱的测定条件为：电离方式：电子轰击EI离子源；电离能量：70eV；离子源温度：275-285℃；扫描模式：正离子模式或SIM模式；采集速率：0.1-0.3s/scan；质量范围：50-400m/z。