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PRRSV N蛋白的原核可溶性表达方法及间接ELISA抗体检测方法
| 专利名称： | PRRSV N蛋白的原核可溶性表达方法及间接ELISA抗体检测方法 |
| 摘要： | 本发明公开了一种PRRSV N蛋白的原核可溶性表达方法及间接ELISA抗体检测方法，PRRSV N蛋白的原核可溶性表达方法包括(1)根据大肠杆菌密码子偏嗜性特征，人工优化并合成PRRSV N蛋白编码基因；(2)以MBP作为促溶标签，构建N蛋白原核表达载体；(3)MBP融合N蛋白表达与纯化；再通过间接ELISA抗体检测方法进行特异性试验。本发明以带有MBP标签的PMAL‑C4X作为表达载体，实现了PRRSV N蛋白在大肠杆菌中的高效可溶性表达，诱导培养在接近室温进行，无需加热或降温设备，目的蛋白洗脱采用10mmoL/L麦芽糖溶液，洗脱效果好，用量少，节约成本。本发明以融合N蛋白为包被抗原建立的间接ELISA抗体检测方法特异性强；本发明建立间接ELISA抗体检测方法与IDEXX同类试剂盒的总符合率为90％左右。 |
| 专利类型： | 发明专利 |
| 国家地区组织代码： | 甘肃;62 |
| 申请人： | 中国农业科学院兰州兽医研究所 |
| 发明人： | 张杰;张永光;丁耀忠;刘永生;代军飞;王俊;马炳;欧云文;孙跃峰;吕建亮;邵军军;周鹏 |
| 专利状态： | 有效 |
| 发布日期： | 2019-01-01T00:00:00+0800 |
| 申请号： | CN201810149238.9 |
| 公开号： | CN108508210A |
| 代理机构： | 北京中誉威圣知识产权代理有限公司 11279 |
| 代理人： | 席勇 |
| 分类号： | G01N33/68(2006.01)I;C12N15/70(2006.01)I;C12N15/40(2006.01)I;C07K14/08(2006.01)I;G;C;G01;C12;C07;G01N;C12N;C07K;G01N33;C12N15;C07K14;G01N33/68;C12N15/70;C12N15/40;C07K14/08 |
| 申请人地址： | 730046 甘肃省兰州市城关区盐场堡徐家坪1号 |
| 主权项： | 1.一种PRRSV N蛋白的原核可溶性表达方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)根据大肠杆菌密码子偏嗜性特征，人工优化并合成PRRSV N蛋白编码基因，所述PRRSV N蛋白编码基因序列如SEQ ID NO.1所示；(2)以MBP作为促溶标签，构建N蛋白原核表达载体设计PCR引物，对所述合成的PRRSV N蛋白编码基因进行PCR扩增，所述引物序列如下：上游引物为F：5'‑CGGAATTCATGCCAAATAACAACGGCAAG‑3'，下划线为EcoRⅠ酶切位点；下游引物为R：5'‑AACTGCAGTCATGCTGAGGGTGATGCTGTG‑3'，下划线为PstⅠ酶切位点；PCR扩增反应体系为：按体积百分含量计，Ex‑Taq预混酶50％、上游引物和下游引物各3％、模板2％、余量为蒸馏水；利用EcoRⅠ和PstⅠ分别双酶切PCR产物和带有MBP标签的PMAL‑C4X载体，反应体系为：按体积百分含量计，胶回收产物12.5％，线性化后PMAL‑C4X载体50％，10x Buffer H 10％，EcoRⅠ5％，PstⅠ5％，余量为ddH2O；筛选阳性重组质粒；(3)MBP融合N蛋白表达与纯化将(2)中筛选的阳性重组质粒转入培养液中诱导表达；再进行裂解、离心，将直链淀粉树脂加入到层析柱中，用缓冲液洗涤树脂，然后将离心收集的上清液加入到层析柱中进行分离纯化，最后加入麦芽糖溶液洗脱目的蛋白，将麦芽糖用PBS置换。 |
| 所属类别： | 发明专利 |
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