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原文传递用于从生物样品中测定免疫球蛋白γ(IgG)抗体同种型浓度的方法和试剂

专利名称：	用于从生物样品中测定免疫球蛋白γ(IgG)抗体同种型浓度的方法和试剂
摘要：	本文公开了用于从生物样品中测定免疫球蛋白γ(IgG)抗体同种型浓度以及用于分析IgG抗体产生用的多个细胞样品的方法和试剂。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	美国;US
申请人：	埃森仪器公司DBA埃森生物科学公司
发明人：	Z·刘;T·杜恩辛
专利状态：	有效
申请日期：	2017-11-28T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-27T00:00:00+0800
申请号：	CN201780083652.8
公开号：	CN110178034A
代理机构：	北京市中伦律师事务所
代理人：	钟锦舜;酒向飞
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	美国密歇根州
主权项：	1.一种从生物样品中测定免疫球蛋白γ(IgG)抗体同种型浓度的方法，包括： (a)在微量滴定板中的多个孔中，将含有IgG抗体的生物样品与检测试剂一起温育，其中所述检测试剂包含一种或多种可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段，其中所述温育在促进所述可检测标记的靶IgG蛋白或其片段与其所述IgG抗体均匀混合的时间和条件下发生，以在所述多个孔的每个孔中产生IgG抗体-靶IgG蛋白混合物； (b)将所述多个孔的每个孔中的所述IgG抗体-靶IgG蛋白混合物与一种或多种IgG同种型特异性捕获试剂群一起温育，其中每种IgG同种型特异性捕获试剂群包含选择性结合不同特异性IgG蛋白同种型的结合分子，其中每种IgG同种型特异性捕获试剂群中的所述结合分子与表面结合，其中所述温育在促进所述一种或多种可检测标记的靶IgG蛋白或其片段和所述IgG抗体结合至所述IgG同种型特异性捕获试剂群的时间和条件下进行，以产生IgG同种型特异性结合复合物；以及 (c)检测来自所述IgG同种型特异性结合复合物的信号，以确定所述生物样品中存在的一种或多种IgG抗体同种型的浓度，其中所述生物样品中存在的IgG抗体同种型的量与从相关IgG同种型特异性结合复合物中检测到的所述信号成反比。 2.根据权利要求1所述的方法，还包括 (d)温育对照样品的系列稀释液和所述检测试剂以产生对照混合物，其中所述对照样品的所述系列稀释液的每种稀释液存在于微量滴定板的单独孔中，其中所述对照样品包含对应于所述检测试剂中的所述一种或多种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段的一种或多种不同的未标记的IgG蛋白同种型或其片段，其中所述温育发生在促进所述对照样品中所述未标记的IgG蛋白同种型和一种或多种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段混合的时间和条件下； (e)将所述对照混合物与所述一种或多种IgG同种型特异性捕获试剂群一起温育，其中所述温育在促进所述一种或多种可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段和所述一种或多种不同的未标记的IgG蛋白同种型或其片段与所述一种或多种IgG同种型特异性捕获珠群竞争性结合的时间和条件下进行，以产生对照IgG同种型特异性结合复合物；以及 (f)通过分析来自所述IgG同种型特异性结合复合物的所述信号产生每种IgG蛋白同种型的标准曲线，其中每种生物样品中的一种或多种IgG抗体同种型的浓度通过参考所述每种IgG蛋白同种型的标准曲线来测量。 3.一种用于从生物样品中测定免疫球蛋白γ(IgG)同种型抗体浓度的方法，包括： (a)在微量滴定板中的多个孔中，将表达IgG抗体的多个生物样品与一种或多种IgG同种型特异性捕获试剂群一起温育，其中每种IgG同种型特异性捕获试剂群包含选择性结合不同特异性IgG蛋白同种型的结合分子，其中每种IgG同种型特异性捕获试剂群中的所述结合分子与表面结合；其中所述温育在促进所述IgG抗体与所述IgG同种型特异性捕获试剂的结合的时间和条件下进行，以产生IgG抗体-IgG同种型特异性捕获试剂复合物； (b)将所述IgG抗体-IgG同种型特异性捕获试剂复合物与检测试剂一起温育，其中所述检测试剂包含一种或多种可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段，其中所述温育在促进所述可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段与所述IgG同种型特异性捕获试剂复合物上的未占据位点结合的时间和条件下发生，以产生可检测标记的靶IgG蛋白-IgG抗体-IgG同种型特异性捕获试剂复合物； (c)在所述可检测标记的靶IgG蛋白-IgG抗体-IgG同种型特异性捕获试剂复合物上检测来自所述可检测标记的靶IgG蛋白的信号，以确定一种或多种IgG抗体同种型的浓度，其中存在于所述生物样品中的IgG抗体同种型蛋白的量与检测到的信号成反比。 4.根据权利要求3所述的方法，还包括 (d)温育对照样品的系列稀释液与一种或多种IgG同种型特异性捕获试剂群以产生对照混合物，其中所述对照样品的所述系列稀释液的每个稀释液存在于微量滴定板的单独孔中，其中所述对照样品包含对应于所述检测试剂中的所述一种或多种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段的一种或多种不同的未标记的IgG蛋白同种型或其片段，其中所述温育在促进所述一种或多种不同的未标记的IgG蛋白同种型与所述IgG同种型特异性捕获试剂结合的时间和条件下进行，以产生对照复合物； (e)将所述对照复合物与所述检测试剂一起温育，其中所述温育在促进一种或多种可检测标记的IgG蛋白同种型或其片段与所述IgG同种型特异性捕获试剂上的未占据位点的结合的时间和条件下进行；并且 (f)通过分析来自与所述IgG同种型特异性捕获试剂群结合的可检测标记的IgG同种型的信号，产生每种IgG蛋白同种型的标准曲线，其中通过参考每种IgG蛋白同种型的所述标准曲线，测量每种生物样品中一种或多种IgG同种型的浓度。 5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述检测试剂包含确定比例的两种或更多种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段，并在每个生物样本中确定两种或更多种IgG抗体同种型的浓度。 6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述检测试剂包含确定比例的三种或更多种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段，并确定在每个生物样本中三种或更多种IgG抗体同种型的浓度。 7.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述检测试剂包含确定比例的四种或更多种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其片段，并确定在每个生物样本中四种或更多种IgG抗体同种型的浓度。 8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述检测试剂还包含可检测的细胞活力标记，并且其中所述方法还包括测量每种生物样品中的细胞活力和/或细胞数。 9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述结合分子结合的所述表面包含珠粒。 10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中每个捕获试剂群是可单独区分的。 11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述结合分子包含抗体、affimers适体和/或Fc受体。 12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述方法还包括确定每种生物样品中的总IgG抗体浓度。 13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含细胞样品。 14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述生物样品是未稀释的样品。 15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述方法不包括任何洗涤步骤。 16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含小鼠B细胞或者小鼠细胞杂交瘤上清液，所述上清液具有或不具有细胞，其中所述不同的IgG同种型选自小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、和IgG3。 17.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含人细胞，其中所述不同的IgG同种型选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。 18.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含大鼠细胞，其中所述不同的IgG同种型选自大鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c。 19.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括： (i)兔细胞或绵羊细胞，其中所述不同的IgG同种型选自兔或绵羊IgG； (ii)山羊细胞、猪细胞或牛细胞，其中所述不同的IgG同种型选自山羊、猪或牛IgG1和IgG2； (iii)马细胞，其中所述不同的IgG同种型选自马IgG1、IgGb、IgGt；或者 (iv)猴细胞，其中所述不同的IgG同种型选自猴IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。 20.一种试剂盒，包括： (a)检测试剂，其包含确定比例的两种或更多种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其抗原性片段；和 (b)两种或更多种捕获试剂群，其中每种捕获试剂群包含选择性结合不同IgG抗体同种型的结合分子，其中每种捕获试剂群中的所述结合分子与表面结合。 21.根据权利要求20所述的试剂盒，其中所述表面包含珠粒。 22.根据权利要求20或21所述的试剂盒，其中每个捕获试剂群是可单独区分的。 23.根据权利要求20-22中任一项所述的试剂盒，其中所述结合分子包含抗体。 24.根据权利要求20-23中任一项所述的试剂盒，还包括： (c)对照样品，其包含确定比例的两种或更多种不同的未标记的IgG蛋白同种型或其抗原性片段，所述两种或更多种不同的未标记的IgG蛋白同种型或其抗原性片段对应于所述检测试剂中的所述两种或更多种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其抗原性片段。 25.根据权利要求20-24中任一项所述的试剂盒，其中：所述检测试剂包括确定比例的三种或更多种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其抗原性片段；和所述捕获试剂包含三种或更多种捕获试剂群。 26.根据权利要求20-24中任一项所述的试剂盒，其中：所述检测试剂包括确定比例的四种或更多种不同的且可检测标记的靶IgG蛋白同种型或其抗原性片段；和所述捕获试剂包含四种或更多种捕获试剂群。 27.根据权利要求25-26中任一项所述的试剂盒，其中所述对照样品包含确定比例的三种或更多种或四种或更多种不同的且未标记的IgG蛋白同种型或其抗原性片段，所述三种或更多种或四种或更多种不同的且未标记的IgG蛋白同种型或其抗原性片段对应于在所述检测试剂中的所述三种或更多种或四种或更多种不同的且可检测标记的IgG蛋白同种型或其抗原性片段。 28.根据权利要求20-27中任一项所述的试剂盒，其中：所述检测试剂包括确定比例的2、3或4种不同的且可检测标记的靶小鼠IgG蛋白同种型，其选自gG1、IgG2a、IgG2b和IgG3或其抗原性片段；和所述捕获试剂包含2、3或4种捕获试剂群，其中每个捕获试剂群包含选择性结合选自IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3的不同小鼠IgG抗体同种型的结合分子。 29.根据权利要求20-27中任一项所述的试剂盒，其中：所述检测试剂包括确定比例的2、3或4种不同的且可检测标记的靶人IgG蛋白同种型，其选自gG1、IgG2、IgG3和IgG4或其抗原片段；和所述捕获试剂包含2、3或4种捕获试剂群，其中每个捕获试剂群包含选择性结合选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的不同人IgG抗体同种型的结合分子。 30.根据权利要求20-27中任一项所述的试剂盒，其中：所述检测试剂包括限定比例的2、3或4种不同的且可检测标记的靶大鼠IgG蛋白同种型，其选自IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c或其片段；和所述捕获试剂包含2、3或4种捕获试剂群，其中每个捕获试剂群包含选择性结合选自IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c的不同大鼠IgG抗体同种型的结合分子。 31.根据权利要求20-27中任一项所述的试剂盒，其中， (A)检测试剂包括确定比例的： (i)2种不同的且可检测标记的靶山羊、猪或牛IgG蛋白同种型，选自IgG1、IgG2或其片段； (ii)2或3种不同的且可检测标记的靶马IgG蛋白同种型，选自IgGa、IgGb、IgGt或其片段；或者 (iii)2、3或4种不同的且可检测标记的靶猴IgG蛋白同种型，选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其片段；并且 (B)捕获试剂包括 (i)2种捕获试剂群，其中每种捕获试剂群包含选择性结合选自IgG1、IgG2或其片段的不同靶山羊、猪或牛IgG蛋白同种型的结合分子； (ii)2或3种捕获试剂群，其中每种捕获试剂群包含选择性结合选自IgGa、IgGb、IgGt或其片段的不同马IgG蛋白同种型的结合分子；或者 (iii)2、3或4种捕获试剂群，其中每种捕获试剂群包含选择性结合选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其片段的不同猴IgG蛋白同种型的结合分子。 32.一种用于分析多个细胞样品的免疫球蛋白γ(IgG)抗体产生的方法，所述方法包括： (a)将多个细胞样品转移到具有多个样品孔的测定板中，其中每个样品孔含有表达靶IgG抗体的未稀释细胞培养物的细胞样品，并将所述多个细胞样品与分析试剂混合以产生多种分析混合物，其中分析试剂包括： (i)捕获珠，其中所述捕获珠与IgG抗体结合；和 (ii)第一检测分子，其包含(A)对照IgG抗体或其片段，和(B)第一可检测部分； (b)将所述多种分析混合物在促进所述靶IgG抗体和所述第一检测分子与所述捕获珠的结合的时间和条件下温育；和 (c)通过流式细胞术分析确定所述多种分析混合物的每种分析混合物中的所述目标IgG抗体浓度。 33.根据权利要求32所述的方法，其中所述细胞培养物从单个克隆繁殖。 34.根据权利要求32或权利要求33所述的方法，其中所述捕获珠与蛋白G或蛋白A共价连接。 35.根据权利要求32-34中任一项所述的方法，其中所述捕获珠粒是磁珠或琼脂糖珠。 36.根据权利要求32-35中任一项所述的方法，其中所述测定板在转移所述多个样品之前含有冻干的分析试剂。 37.根据权利要求32-36中任一项所述的方法，其中将所述分析试剂与所述多个样品混合包括将所述分析试剂添加到所述孔中的所述细胞样品中。 38.根据权利要求32-37中任一项所述的方法，其中在流式细胞仪中读取所述测定板中的所述多种分析混合物之前，将所述测定板离心。 39.根据权利要求32-38中任一项所述的方法，其中所述混合包括同时混合所述多种细胞样品和所有分析试剂，其中所述第一检测分子与所述靶IgG抗体竞争结合所述捕获珠；并且其中在每种分析混合物中与所述捕获珠结合的所述第一检测分子的量提供给定分析混合物中所述靶IgG抗体浓度的测量。 40.根据权利要求32-38中任一项所述的方法，其中所述混合包括逐步添加所述捕获珠和所述第一检测分子，其中所述逐步添加包括：首先将所述多个细胞样品与所述捕获珠在促进所述靶IgG抗体与所述捕获珠结合的时间和条件下混合，以产生多个第一混合物，然后将所述第一检测分子加入所述多个第一混合物中，在促进所述第一检测分子与所述捕获珠结合的时间和条件下，以产生多种分析混合物；其中在每种分析混合物中与所述捕获珠结合的所述第一检测分子的量提供给定分析混合物中所述靶IgG抗体浓度的测量。 41.一种用于分析多个细胞样品的免疫球蛋白γ(IgG)抗体产生的方法，所述方法包括： (a)将多个细胞样品转移到具有多个样品孔的测定板中，其中每个样品孔含有表达靶IgG抗体的未稀释细胞培养物的细胞样品，并将所述多个细胞样品与分析试剂混合以产生多种分析混合物，其中所述分析试剂包括： (i)捕获珠，其中所述捕获珠与IgG抗体结合；和 (ii)包含第一可检测部分的第一检测分子； (b)将所述多种分析混合物在促进所述靶IgG抗体和所述第一检测分子与所述捕获珠的结合的时间和条件下温育；并且 (c)通过流式细胞术分析确定所述多种分析混合物的每种分析混合物中的所述目标IgG抗体浓度。 42.根据权利要求41所述的方法，其中所述第一检测分子缺乏免疫球蛋白轻链并且能够结合所述捕获珠。 43.根据权利要求42所述的方法，其中所述方法还包括使所述多种分析混合物与第二检测分子在促进所述第二检测分子与结合于所述捕获珠的所述靶IgG抗体结合的时间和条件下接触；其中所述第二检测分子包含可检测标记的抗-IgG轻链抗体，其与所述第一检测分子在光学上可区分；和其中在每种分析混合物中与所述靶IgG抗体结合的所述第二检测分子的量提供给定分析混合物中完整靶IgG抗体浓度的测量。 44.根据权利要求43所述的方法，其中将所述多种分析混合物离心并在加入所述标记的抗轻链抗体之前进行洗涤步骤。 45.根据权利要求32-44中任一项所述的方法，其中所述分析试剂还包含细胞活力染料、细胞表面生物标志物或细胞凋亡标志物中的一种或多种。 46.根据权利要求31-45中任一项所述的方法，还包括确定以下中的一个或多个： (i)每种分析混合物中的多种细胞； (ii)每种分析混合物中活细胞的百分比； (ii)每种分析混合物中每个细胞的靶IgG抗体浓度；和/或 (iii)每种分析混合物中每个活细胞的靶IgG抗体浓度。 47.一种试剂盒，包括： (a)测定板，和 (b)分析试剂，其中所述分析试剂包括： (i)捕获珠，其中所述捕获珠与IgG抗体结合；和 (ii)包含第一可检测部分的第一检测分子。 48.根据权利要求47所述的试剂盒，其中所述第一检测分子包含对照IgG抗体或其片段。 49.根据权利要求47或48所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含可检测标记的与所述第一检测分子在光学上可区分的抗轻链抗体。 50.根据权利要求47-49中任一项所述的试剂盒，其中所述分析试剂还包含细胞活力染料、细胞表面生物标志物或细胞凋亡标志物中的一种或多种。 51.根据权利要求47-50中任一项所述的试剂盒，其中所述捕获珠与蛋白G或蛋白A共价连接。 52.根据权利要求47-51中任一项所述的试剂盒，其中所述捕获珠粒是磁珠或琼脂糖珠。 53.根据权利要求47-52中任一项所述的试剂盒，其中所述测定板含有冻干的分析试剂。
所属类别：	发明专利