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原文传递一种同时检测GA I和II型尿液异常代谢化合物的方法

专利名称：	一种同时检测GA I和II型尿液异常代谢化合物的方法
摘要：	本发明公开了一种对尿液进行前处理的方法以及基于该方法同时检测GA I和II型尿液异常代谢化合物的方法。所述对尿液进行前处理的方法如下：在尿液中加入尿素酶，然后进行孵育；将尿素酶处理后的尿液样本，加入内标十七烷酸及无水乙醇，充分混匀，离心，取上清液，用氮气吹干，残余物中加入BSTFA和TMCS，进行三甲基硅烷化衍生化处理。然后对处理后的尿液用GC‑MS分析。利用代谢状况无异常的儿童尿液代谢物检测结果作为基准，通过各特征代谢化合物检测值与基准值的比较进行GA I和II型诊断。运用该方法，无需标准品和先验者样本，只要仪器设备满足要求，利用患者的尿液或干尿滤纸片均能准确实现GA的诊断及分型鉴别。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	中国人民解放军总医院第七医学中心
发明人：	张万巧;王艳;封志纯;杨尧
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-10T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-06T00:00:00+0800
申请号：	CN201910387725.3
公开号：	CN110095542A
代理机构：	北京纪凯知识产权代理有限公司
代理人：	赵静
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	100700 北京市东城区东四十条南门仓5号
主权项：	1.一种对尿液样本进行前处理的方法，包括下述步骤： (1)尿素酶预处理：在尿液样本中加入尿素酶，然后进行孵育； (2)将步骤(1)尿素酶处理后的尿液样本，加入内标十七烷酸及无水乙醇，充分混匀，离心，取上清液，用氮气吹干，残余物中加入双(三甲基硅基)三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷，进行三甲基硅烷化衍生化处理，即得。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述尿素酶以尿素酶水溶液的形式加入，所述尿素酶水溶液的浓度为30～60 Units/30μl；所述尿液样本与所述尿素酶溶液的配比为100μl：30μl；所述孵育的条件为：37℃孵育20～45min。 3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述尿液样本任选下述一种： 1)新鲜尿液； 2)采集新鲜尿液，8小时以内分装到EP管，-20℃保存，处理前解冻使用； 3)用滤纸片浸透所述新鲜尿液，于干燥避光处阴干，将得到的干尿滤纸片密封后于-20℃保存；处理前将所述干尿滤纸片放入5ml注射器内，抽取1ml去离子水，室温静置5min，反复抽拉针筒，收集尿滤纸片浸出液；其中，所述滤纸为国产新华3号滤纸，规格5×8cm。 4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述尿液样本与无水乙醇的体积为100μl：1000μl；所述十七烷酸在所述尿液样本的浓度为200ppm；所述离心的条件为：13000rpm离心5～10min；所述双(三甲基硅基)三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷的体积比为99:1；所述尿液样本的体积与双(三甲基硅基)三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷的体积之和的比为100μl：100μl。 5.一种采用GC-MS同时测定尿液中的戊二酸、乙基丙二酸、3羟基戊二酸、2羟基戊二酸、己二酸、辛二酸、癸二酸以及内源性肌酐的方法，包括下述步骤： a)采用权利要求1-4中任一项所述的方法对尿液样本进行处理； b)采用气相色谱-单四级杆质谱进行分析；所述气相色谱-质谱的分析条件如下：气相色谱柱为基于亚苯基硅烷固定相的非极性毛细管柱，规格：30m×0.25mmID×0.25μm；进样量1μl；分流进样，其中分流比为20；进样口温度250℃；氦气流速1.0ml/min；恒流；柱温箱起始温度60℃，维持2min，以10℃/min的速度升温至220℃，维持3min；再以15℃/min的速度升温至325℃，维持5min；离子源温度280℃，传输线温度300℃，扫面范围50-550m/z，样本分析时间33min。 6.一种对尿液样本进行测定的系统在制备辅助诊断戊二酸尿症Ⅰ型或II型产品中的应用；所述对尿液样本进行测定的系统包括采用权利要求5所述方法对尿液样本进行预处理和采用气相色谱-单四级杆质谱进行检测时所需的各种试剂和/或仪器。 7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述系统包括对尿液样本进行预处理的系统以及对预处理后的尿液样本采用气相色谱-单四级杆质谱进行检测的系统；所述对尿液样本进行预处理的系统包括采用权利要求1-4中任一项所述方法对尿液样本进行预处理时所需的各种试剂和/或仪器；所试剂包括：尿素酶、十七烷酸、无水乙醇、双(三甲基硅基)三氟乙酰胺、三甲基氯硅烷；所述仪器包括：孵育设备、离心设备；所述对预处理后的尿液样本采用气相色谱-单四级杆质谱进行检测的系统包括：气相色谱-质谱仪、氦气。 8.一种对尿液样本进行检测的系统以及载体在制备辅助诊断戊二酸尿症Ⅰ型或II型产品中的应用；所述对尿液样本进行检测的系统为权利要求6或7所述的系统；所述载体选自下述载体1，或，载体1和载体2；所述载体1为记载有与戊二酸尿症Ⅰ型或II型疾病相关的代谢物的质谱信息的载体；所述载体1上记载的与戊二酸尿症Ⅰ型疾病相关的代谢物的质谱信息如下：戊二酸保留时间 11.69min、特征离子261； 3羟基戊二酸保留时间 13.71min、特征离子349；所述载体1上记载的与戊二酸尿症II型疾病相关的代谢物的质谱信息如下：所述载体2为记载有操作步骤和判断标准的载体；所述载体2中记载的操作步骤和判断标准如下： (a1)按照本发明所述的尿液测定方法检测待测儿童的尿液，将尿样本GCMS结果通过与所述载体1记载的代谢物的质谱信息比对进行定性； (b1)定量采用半定量法，利用人尿液中肌酐作为内标，用单一代谢化合物的峰面积与肌酐峰面积的比值作为该代谢化合物的响应值；所述肌酐的质谱信息为：保留时间13.45min、特征离子329； (c1)将各个代谢化合物的响应值与正常儿童尿样本中对应的代谢物的响应正常上限值进行比对，并利用各个代谢化合物的响应值与其对应的代谢物的响应正常上限值的比值计算升高倍率，升高倍率大于3的判断为增高；如果待测者戊二酸、3羟基戊二酸均增高，则判断为或疑似为GA I型；如果待测者戊二酸、乙基丙二酸、2羟基戊二酸均增高，则判断为或疑似为GA II型；所述正常儿童尿样本中对应的代谢物的响应正常上限值通过下述方法获得：按照本发明尿液测定方法测定至少500名代谢正常儿童尿样本中GA、EMA、3HG、2HG、adipate、suberate和sebacate的GCMS响应值，取各代谢化合物响应值的99.5百分位数作为正常上限值；所述儿童的年龄为1月至一周岁。 9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述正常儿童尿样本中对应的代谢物的响应正常上限值如下所示：所述戊二酸的正常上限值为0.8；所述3羟基戊二酸的正常上限值为1.50；所述乙基丙二酸的正常上限值为1.04；所述2羟基戊二酸的正常上限值为1.50；所述己二酸的正常上限值为0.58；所述辛二酸的正常上限值为0.86；所述癸二酸的正常上限值为0.80。 10.一种辅助诊断戊二酸尿症Ⅰ型或II型的产品，包括对尿液进行测定的系统以及载体；所述对尿液进行测定的系统为权利要求9中所述的系统；所述载体为权利要求9中所述的载体。
所属类别：	发明专利