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原文传递一种菟丝子拟雌激素作用质量标志物的筛选方法及其特征图谱的构建与应用

专利名称：	一种菟丝子拟雌激素作用质量标志物的筛选方法及其特征图谱的构建与应用
摘要：	一种菟丝子拟雌激素作用质量标志物的筛选方法及其特征图谱的构建与应用，属于中药质量控制技术领域，针对如何筛选菟丝子拟雌激素作用质量标志物以及如何把控菟丝子质量的问题，本发明以小粒菟丝子为研究对象，采用小鼠子宫增重实验、子宫上皮组织染色以及雌激素水平检测实验来评价菟丝子不同极性部位的雌激素活性，结合UPLC/Q‑TOF‑MS对菟丝子不同极性部位分析得到的指纹图谱，进行谱效分析得到与10个与拟雌激素作用高度关联的成分，并结合成分解析的结果，进一步建立其特征图谱，本发明可用于菟丝子质量控制。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	黑龙江;23
申请人：	哈尔滨商业大学
发明人：	李文兰;孙向明;胡扬;宋辉;徐蓓蕾;温静
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-26T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-17T00:00:00+0800
申请号：	CN201910560929.2
公开号：	CN110243967A
代理机构：	哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司
代理人：	邓宇
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	150000 黑龙江省哈尔滨市南岗区通达街138号
主权项：	1.一种菟丝子拟雌激素作用质量标志物的筛选方法，其特征在于，包括步骤如下： 1)菟丝子提取物的制备：称取菟丝子，粉碎后，按照1g:(8-12)mL的料液比，加入体积分数为95％的乙醇溶液，浸泡12-18h，88-92℃加热回流提取2-3h，过滤回收滤液，得到菟丝子提取物； 2)不同极性部位提取物制备：将步骤1)获得的菟丝子提取物，利用大孔吸附树脂，分别经体积分数为30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％的乙醇溶液洗脱，得到不同洗脱部位的洗脱液，分别记为S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8；将各洗脱液浓缩至浸膏，备用；将步骤1)获得的菟丝子提取物，分别经正丁醇、乙酸乙酯、石油醚萃取，取有机相层获得不同萃取部位的萃取物，分别记为S9、S10、S11，将各萃取物浓缩至浸膏，备用； 3)构建指纹图谱：利用UPLC-Q-TOFMS对上述获得的浸膏S1-S11进行成分分析，分别在正、负两种离子模式下进行数据扫描，获得谱图即为指纹图谱； 4)谱效相关性分析：分别将步骤3)中获得的指纹图谱进行均值化处理，采用双变量相关性分析以及灰关联度分析，确定拟雌激素作用高度相关的成分，得到质量标志物。 2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤2)所述大孔径树脂在使用前进行预处理，方法为：将大孔树脂浸渍于体积分数为95％的乙醇溶液中，乙醇液位高于树脂层2cm，每3～4小时更换一次乙醇，直到树脂的乙醇洗涤液与水混合后不发生浑浊为止，用蒸馏水清洗树脂上残留的乙醇。 3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤3)所述UPLC-Q-TOFMS的色谱条件为：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18；保护柱为ACQUITY UPLC BEH C18；流速：0.3mL/min；柱温：40℃；进样量：1μL，以乙腈与质量分数为0.1％的甲酸溶液为流动相进行梯度洗脱，洗脱梯度为：0-2min，流动相中乙腈体积比为10％-19％；2-5min,流动相中乙腈体积比为19％；5-6min，流动相中乙腈体积比为19％-44％，6-14min流动相中乙腈体积比为44％-60％；14-19min,流动相中乙腈体积比为60％-95％；19-20min，流动相中乙腈体积比为95％-100％；采集时间为20min；所述UPLC-Q-TOFMS的质谱条件为：VION质谱仪，电压：2.0/3.0kv，离子源温度：120℃，去溶剂气温度：500℃；去溶剂气流速：1000L/h，锥孔气流速：50L/h，采集模式：MSE；选择正、负离子扫描方式，采集时间20min,扫描范围：m/z50-1000，碰撞能：20-45mV。 4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤3)所述数据扫描后利用WatersMasslynx 4.1和UNIFI 1.7软件进行数据分析，数据收集时，方法参数为：保留时间范围0至18分钟；质量范围50至1000Da；保留时间误差限0.01分钟；质量误差限0.01Da。 5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤4)所述双变量相关性分析以及灰关联度分析所采用的变量包括小鼠子宫系数、小鼠子宫内膜厚度、雌二醇、促黄体生成素和卵泡生成激素水平。 6.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤4)所述双变量相关性分析方法为:分别给予小鼠步骤2)获得的不同洗脱部位以及不同萃取部位的菟丝子提取物，测定各组小鼠子宫系数、小鼠子宫内膜厚度、雌二醇、促黄体生成素、卵泡生成激素水平，以均值化后的指纹图谱共有峰峰面积与小鼠子宫系数、子宫内膜厚度、小鼠的雌二醇、促黄体生成素、卵泡生成激素水平为变量，采用SPSS19.0统计分析软件中的双变量相关分析法进行数据处理，计算各变量之间的Pearson相关系数，相关系数的绝对值越大，表明两个变量之间的线性相关性越强；所述灰关联度分析是指将分别给予小鼠步骤2)获得的不同洗脱部位以及不同萃取部位的菟丝子提取物，测定各组小鼠子宫系数、小鼠子宫内膜厚度、雌二醇、促黄体生成素、卵泡生成激素水平，以均值化后的指纹图谱共有峰峰面积与小鼠子宫系数、小鼠子宫内膜厚度、雌二醇、促黄体生成素、卵泡生成激素水平为母序列，使用DPS数据分析系统进行灰关联度分析，将子序列对相同母序列的关联度按从大到小的顺序排序，关联度>0.5表示子序列与母序列之间有着一定的关联性，关联度的数值越高，说明关联性就越强。 7.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述给予小鼠步骤2)获得的菟丝子提取物的剂量为16g·kg-1·d-1(以生药计)，给药4天，每日两次。 8.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤4)获得的质量标志物包括6-O-(反式)对香豆酰基-呋喃果糖-(2→1)-吡喃葡萄糖苷、新菟丝子苷、C、2,6-十八碳二炔酸、金丝桃苷、紫云英苷、豆甾醇、槲皮素、山奈酚、异鼠李素和芹菜素。 9.权利要求1所述筛选方法获得的质量标志物特定图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤： 1)供试品溶液的制备：菟丝子粉碎后，按照1g：(8-12)mL的料液比，加入体积分数为95％的乙醇溶液，浸泡12-18h，88-92℃加热回流提取2-3h，过滤回收滤液，得到菟丝子提取物，称取提取物，以体积分数为40％的乙腈溶液为溶剂，制成质量浓度为0.02g·mL-1(以生药计)的供试品溶液； 2)对照品溶液的制备：用甲醇配制每5mL含有金丝桃苷4.5mg、槲皮素6.5mg、芹菜素6.0mg、山奈酚3.3mg、异鼠李素5.8mg的对照品溶液； 3)UPLC分析：利用UPLC方法对不同批次供试品溶液以及对照品溶液进行色谱检测，以权利要求1获得的质量标志物作为特征图谱的特征峰，构建获得特征图谱；上述不同批次的特征图谱的相似度均大于0.9；以4号峰金丝桃苷为对照峰，各特征峰的相对保留时间和相对标准偏差为： 1号峰，相对保留时间：0.345；相对标准偏差0.43％； 2号峰，相对保留时间：0.828；相对标准偏差0.69％； 3号峰，相对保留时间：0.855；相对标准偏差0.42％； 4号峰，相对保留时间：1.000；相对标准偏差0.00％； 5号峰，相对保留时间：1.031；相对标准偏差0.71％； 6号峰，相对保留时间：1.465；相对标准偏差0.41％； 7号峰，相对保留时间：2.433；相对标准偏差0.31％； 8号峰，相对保留时间：2.719；相对标准偏差0.19％； 9号峰，相对保留时间：2.777；相对标准偏差0.18％； 10号峰，相对保留时间：2.817；相对标准偏差0.15％。 10.权利要求9所述构建方法获得的特定图谱在菟丝子质量控制中的应用。
所属类别：	发明专利