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原文传递一种急性肝衰竭小鼠肝脏全免疫细胞特征图谱的绘制方法

专利名称：	一种急性肝衰竭小鼠肝脏全免疫细胞特征图谱的绘制方法
摘要：	本发明涉及肝脏全免疫细胞特征图谱研究，旨在提供一种急性肝衰竭小鼠肝脏全免疫细胞特征图谱的绘制方法。包括步骤：小鼠肝脏全免疫细胞的提取；质谱流式抗体的标记；免疫细胞抗体染色；质谱流式分析。本发明能够在保证细胞纯度的基础上，尽可能的去除肝脏实质细胞，分离出高得率的小鼠肝脏全免疫细胞。本发明分离的小鼠肝脏全免疫细胞得率在高于研磨法得率，且细胞活率大于传统研磨法。本发明根据肝脏、肺脏中免疫细胞特点，创新性地使用试剂盒以稳定金属同位素与抗体连接，同时基于通道干扰最小原则设计质谱流式通道，实现全面小鼠对肝脏全免疫细胞的分类和功能进行描述，最多可同时检测43个标志物，能够观察到小鼠肝脏全免疫细胞的动态改变。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	浙江大学
发明人：	曹红翠;刘景琪;冯旭东;俞炯;潘巧玲;徐燕萍;曾浔;李兰娟
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-24T00:00:00+0800
发布日期：	2019-10-15T00:00:00+0800
申请号：	CN201910551172.0
公开号：	CN110333357A
代理机构：	杭州中成专利事务所有限公司
代理人：	周世骏
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘路866号
主权项：	1.一种急性肝衰竭小鼠肝脏全免疫细胞特征图谱的绘制方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)小鼠肝脏全免疫细胞的提取取因急性肝衰竭而自然死亡的新鲜小鼠尸体，摘取肝脏并灌流出其内部的血液；将肝脏剪碎后以酶混合液消化半个小时，再进行密度梯度离心和红细胞裂解，得到纯净的小鼠肝脏全免疫细胞； (2)质谱流式抗体的标记使用美国Fluidigm公司的MaxPAR X8抗体偶联试剂盒，以稳定的金属同位素与小鼠肝脏免疫细胞表面标志物抗体连接，得到标记抗体； (3)免疫细胞抗体染色将分离得到的小鼠肝脏全免疫细胞与标记抗体进行孵育，标记免疫细胞； (4)质谱流式分析将标记后的小鼠肝脏全免疫细胞在质谱流式上机分析，采用t-SNE和X-shift算法对所得数据进行分析；然后将不同的细胞亚群的多个检测抗体的表达分布在同一张热图上，并通过viSNE图表现不同标志物的表达以及不同细胞亚群的分布，以此表现小鼠肝脏全免疫细胞的分类图谱。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括： (1.1)用75％酒精棉擦拭小鼠尸体，剪开腹部分离出小鼠肝脏，保留胆囊和至少1厘米长度的主血管； (1.2)以磷酸盐缓冲液经肝门静脉持续灌流、冲洗肝脏，清除内部血液使肝脏从血红色变为白色； (1.3)剥离胆囊和主血管，将肝脏置于含有磷酸盐缓冲液的培养皿内浸洗； (1.4)将肝脏剪碎后置于含有4.7毫升改良杜氏伊格尔培养基和0.3毫升酶混合液的解离管内； (1.5)将解离管放入德国MACS公司GentleMACSTMDissociator解离机器中，以m_liver_03模式运行两次； (1.6)取出解离管，置于37℃恒温、220转/分钟转速的摇床上消化30分钟； (1.7)消化结束后，将解离管再次置于解离机器中，以m_liver_04模式运行两次； (1.8)将解离管内混悬液以100微米滤器过滤到50毫升离心管内，用5毫升磷酸盐缓冲液重悬解离管内残留物后，再次将液体部分过滤至离心管内； (1.9)在室温条件下，以相对离心力300g离心处理10分钟； (1.10)弃掉上清液后，向沉淀内加3毫升36％Percoll细胞分离液；在室温条件下，以相对离心力600g离心处理15分钟； (1.11)弃掉包含肝细胞碎片的上清液，并向沉淀内加入2毫升红细胞裂解液裂解3分钟以完全去除红细胞；然后加入5ml磷酸盐缓冲液终止裂红，在4℃条件下以相对离心力400g离心处理5分钟；弃上清，得到纯净的小鼠肝脏全免疫细胞。 3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液中包括氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和氯化钾，总浓度为0.01摩尔/升，酸碱度7.4。 4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述酶混合液的配置方法为：向100毫升磷酸盐缓冲液里加入12毫克胶原酶Ⅳ、30毫克链酶蛋白酶和5毫克脱氧核糖核酸酶Ⅰ粉末，混匀。 5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：在将剪碎后的肝脏置于解离管内之前，先将含改良杜氏伊格尔培养基和酶混合液的解离管置于37℃水浴中预热5分钟。 6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述Percoll细胞分离液的配置方法为：先将1毫升10倍磷酸盐缓冲液与9毫升percoll原溶液混合均匀，再加入15毫升1倍的磷酸盐缓冲液得到25毫升36％的Percoll分离液。 7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的10倍磷酸盐缓冲液中包括氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和氯化钾，总浓度为0.1摩尔/升，酸碱度7.4。 8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1.9)、(1.10)中启动离心机前，应先将离心机升速降速均调整到最低档。 9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括：先用金属标记物标记多聚物，获得螯合特定金属的多聚体，然后将其用于标记抗体，获得标记抗体。 10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述稳定金属同位素包括：Y-89、In-113、In-115、La-139、Pr-141、Nd-142、Nd-143、Nd-144、Nd-145、Nd-146、Nd-148、Nd-150、Sm-147、Sm-149、Sm-152、Sm-154、Eu-151、Eu-153、Gd-155、Gd-156、Gd-157、Gd-158、Gd-160、Gd-197、Tb-159、Dy-161、Dy-162、Dy-163、Dy-164、Ho-165、Er-166、Er-167、Er-168、Er-170、Tm-169、Yb-171、Yb-172、Yb-173、Yb-174、Yb-176、Lu-175、Pt-198、Bi-209；所述抗体有43个，包括：anti-CD45、anti-CD44、anti-CD19、anti-KI67、anti-CD24、anti-MHC II、anti-B220、anti-CD5、anti-CD43、anti-CD38、anti-Ly6G、anti-Ly6C、anti-CX3CR1、anti-IgD、anti-CD62L、anti-CD11c、anti-TCRd、anti-CD49a、anti-CD80、anti-BST2、anti-CD25、anti-CD3、anti-F4/80、anti-CD115、anti-iNOS、anti-CXCR3、anti-CD27、anti-CD103、anti-ICOS、anti-Argnase I、anti-CD49b、anti-Foxp3、anti-CD127、anti-CD21、anti-CD23、anti-CD138、anti-CD172a、anti-CTLA-4、anti-SiglecF、anti-IgM、anti-CD4、anti-CD8a、anti-CD11b。
所属类别：	发明专利