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原文传递一种分子印迹结合静默区内标SERS技术高精度检测CEA的方法

专利名称：	一种分子印迹结合静默区内标SERS技术高精度检测CEA的方法
摘要：	本发明公开了一种分子印迹结合生物分子拉曼静默区内标SERS技术高精度检测CEA的方法，其先制备带有内标的金银核壳纳米颗粒和带有标记信号的聚多巴胺包金核壳纳米颗粒，然后将金银核壳纳米颗粒组装到金板上作为SERS基底，并在SERS基底上制备一层含有CEA的分子印迹层，而得到能够特异性识别CEA的SERS分子印迹层，再利用CEA分子印迹去特异性捕获溶液中的CEA，然后用抗体修饰的SERS探针去标记捕获到的CEA，最后进行SERS检测，并根据SERS探针的静默区拉曼信号强度与SERS基底内标信号强度的比值，推算溶液中CEA的浓度。本发明可大大提高CEA的检测效率，实现高精度、特异性检测痕量CEA。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	福建;35
申请人：	福建师范大学
发明人：	冯尚源;林学亮;林多;卢玉栋
专利状态：	有效
申请日期：	2019-08-19T00:00:00+0800
发布日期：	2019-10-25T00:00:00+0800
申请号：	CN201910765160.8
公开号：	CN110376379A
代理机构：	福州元创专利商标代理有限公司
代理人：	修斯文;蔡学俊
分类号：	G01N33/574(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	350117 福建省福州市闽侯县上街镇大学城科技路1号,福建师范大学旗山校区
主权项：	1.一种分子印迹结合静默区内标SERS技术高精度检测CEA的方法，其特征在于，包括如下步骤： 1）合成金纳米颗粒Au NPs：在水中加入HAuCl4溶液，搅拌煮沸之后加入还原剂柠檬酸钠溶液，继续搅拌加热15 min，室温冷却，得到Au NPs溶胶； 2）合成带静默区SERS内标的金银核壳结构纳米颗粒Au@MB@Ag@PATP/MPB NPs：在步骤1）所得Au NPs溶胶中加入内标4-巯基苯甲腈溶液，搅拌反应1 h，得到Au@MB NPs溶胶；将其离心洗涤后重悬于超纯水中，并加入抗坏血酸，接着逐滴滴加AgNO3溶液，反应1 h，形成Au@MB@Ag NPs，接着加入对巯基苯胺溶液和4-巯基苯硼酸溶液，搅拌反应1 h，制得Au@MB@Ag@PATP/MPB NPs溶胶，离心洗涤浓缩后重悬于超纯水中； 3）合成Au@MB@Ag@PATP/MPB NPs 阵列：将镀有金膜的板浸泡在多巴胺Tris盐酸缓冲溶液中，搅拌反应1 h，形成聚多巴胺包裹的金板；用移液枪量取步骤2）制备的Au@MB@Ag@PATP/MPB NPs溶胶，缓慢滴于聚多巴胺包裹的金板上形成圆形液滴，然后放在湿盒中反应24 h，形成一层Au@MB@Ag@PATP/MPB NPs圆形阵列； 4）合成识别CEA的SERS传感表面分子印迹阵列CEA-SMIP：在步骤3）制得的Au@MB@Ag@PATP/MPB NPs阵列上滴加CEA溶液，湿盒孵育20 min，接着用PBS冲洗去除非特异吸附的CEA；接着将其浸泡在三元混合溶液中，摇晃振荡1 h，然后用PBS溶液冲洗3次，最终得到含CEA的SERS传感分子印迹；然后用乙酸和SDS的混合溶液洗脱-振荡循环多次以除去CEA模板分子，直到用UV-Vis 光谱法检测不到洗脱液中含有CEA的特征吸收峰后，氮气吹干，得到CEA-SMIP，保存在干燥器中待用； 5）合成用作探针的抗体修饰带静默区SERS信号的聚多巴胺包裹金核壳纳米颗粒Au@EB@PDA@Ab NPs：在步骤1）合成的Au NPs溶胶中加入多巴胺Tris盐酸缓冲溶液和苯乙炔溶液，剧烈搅拌1 h，形成Au@EB@PDA NPs溶胶，离心洗涤过滤后重悬于超纯水中；然后在血清瓶中加入Au@EB@PDA NPs溶胶，并加入癌胚抗体Ab，4℃孵育12 h，接着用BSA溶液封闭表面非特异识别的点位，制备得Au@EB@PDA@Ab NPs溶胶； 6）探针标记：用PBS润洗活化步骤4）制得的CEA-SMIP，接着将一系列含已知浓度CEA标准品的PBS溶液分别滴加到CEA-SMIP上，湿盒孵育20 min，接着用PBS洗掉未吸附的CEA，然后量取步骤5）制得的Au@EB@PDA@Ab NPs 溶胶，滴加到CEA-SMIP上孵育5 min，然用后PBS洗掉未与CEA结合的Au@EB@PDA@Ab NPs； 7）CEA的检测：在一定测试条件下，用拉曼光谱仪测量具不同浓度CEA的Au@EB@PDA@AbNPs探针与Au@MB@Ag@PATP/MPB NPs内标信号，然后以CEA浓度的对数值作为横坐标，静默区SERS探针与内标的信号强度比率作为纵坐标，绘制标准溶液的SERS探针与内标信号强度比率-浓度标准曲线； 8）基于血液样品的强度比率-浓度标准曲线的绘制：取一例待测血液样品，按步骤6）对待测血液样品进行标记，并用拉曼光谱仪在同一条件下进行测量，将得到的静默区SERS探针与内标的信号强度比率利用步骤7）绘制的标准溶液的SERS探针与内标信号强度比率-浓度标准曲线计算出血液样品中CEA的浓度；再采用加标法，按步骤6）标记后，用拉曼光谱仪在同一条件下精确测定加入一系列含已知浓度CEA标准品的血液样品，然后以血液样品中CEA浓度与加标浓度之和的对数值作为横坐标，静默区SERS探针与内标的信号强度比率作为纵坐标，绘制血液样品的SERS探针与内标信号强度比率-浓度标准曲线； 9）未知血液样品中CEA检测：取其他未知CEA浓度的血液样品，按步骤6）对待测血液样品进行标记，并用拉曼光谱仪在同一条件下进行测量，将得到的静默区SERS探针与内标的信号强度比率利用步骤8）绘制的血液样品的SERS探针与内标信号强度比率-浓度标准曲线计算出其中CEA的浓度。 2.根据权利要求1所述的分子印迹结合静默区内标SERS技术高精度检测CEA的方法，其特征在于，步骤2）对巯基苯胺溶液和4-巯基苯硼酸溶液加入后体系中对巯基苯胺和4-巯基苯硼酸的摩尔浓度比为1:75。 3.根据权利要求1所述的分子印迹结合静默区内标SERS技术高精度检测CEA的方法，其特征在于，步骤4）所述三元混合溶液为多巴胺、氨基苯硼酸和过硫酸铵的PBS溶液，其中，多巴胺、氨基苯硼酸和过硫酸铵的质量比为5:4:3。 4. 根据权利要求1所述的分子印迹结合静默区内标SERS技术高精度检测CEA的方法，其特征在于，步骤4）所述乙酸和SDS的混合溶液中乙酸浓度为0.1 mol/L，SDS的质量分数为10%。 5. 根据权利要求1所述的分子印迹结合静默区内标SERS技术高精度检测CEA的方法，其特征在于，步骤7）所述测试条件为：λ=785 nm，20倍镜，扫描波数范围为400-2400 cm-1，积分1次。 6. 根据权利要求1所述的分子印迹结合静默区内标SERS技术高精度检测CEA的方法，其特征在于，所述静默区SERS探针与内标的信号强度比率为SERS光谱中EB在2024 cm-1峰位的强度与MB在2224 cm-1峰位的强度的比值I2024/I2224。
所属类别：	发明专利