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原文传递一种胶乳微球与抗体复合物的制备方法、产品及其应用

专利名称：	一种胶乳微球与抗体复合物的制备方法、产品及其应用
摘要：	本发明公开了一种胶乳微球与抗体复合物的制备方法、产品及其应用。本发明提供两种制备方法，分别是“两步法”和“一步法”。“两步法”包括：1)羧基胶乳微球与氨基封端聚乙二醇衍生物支架进行反应，制得新型支架‑羧基胶乳微球复合物；2)将步骤1)中制备完成的新型支架‑羧基胶乳微球复合物与抗体进行反应，制得新型支架‑羧基胶乳微球‑抗体复合物。“一步法”包括：将抗体与高分子支架混合均匀，与合适粒径的羧基胶乳微球进行反应，制得新型支架‑羧基胶乳微球‑抗体复合物溶液。采用本发明所提供的制备方法，能够大大增强试剂稳定性、改善校准品线性、大幅度节约生产成本，不仅提高试剂性能，而且降低成本，具有非常好的应用前景。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	北京利德曼生化股份有限公司
发明人：	胡国庆
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-18T00:00:00+0800
发布日期：	2019-11-12T00:00:00+0800
申请号：	CN201910527896.1
公开号：	CN110441514A
代理机构：	北京思元知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	余光军
分类号：	G01N33/543(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	100176北京市大兴区经济技术开发区兴海路5号
主权项：	1.一种通过“两步法”制备胶乳微球与抗体复合物的方法，其特征在于，所述的胶乳微球与抗体复合物为氨基封端聚乙二醇衍生物支架-羧基胶乳微球-抗体复合物，包括如下步骤： 1)选用合适粒径的羧基胶乳微球与氨基封端聚乙二醇衍生物支架进行反应，制得氨基封端聚乙二醇衍生物支架-羧基胶乳微球复合物； 2)将步骤1)中制备完成的氨基封端聚乙二醇衍生物支架-羧基胶乳微球复合物与抗体进行反应，制得氨基封端聚乙二醇衍生物支架-羧基胶乳微球-抗体复合物。 2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤： 1)制备氨基封端聚乙二醇衍生物支架-羧基胶乳微球复合物 1-1)把0.1-1ml质量百分比分数浓度为5-10％的羧基胶乳微球加入5-10ml活化缓冲溶液A，将0.1mg-8mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)加入胶乳微球溶液中进行活化，磁力搅拌，混合均匀，得到EDC活化的羧基胶乳微球溶液； 1-2)将0.01-8ml质量百分比分数浓度10％氨基封端聚乙二醇衍生物溶液加入到EDC活化的羧基胶乳微球溶液中，室温搅拌2-4小时，混合均匀； 1-3)3000g-25000g离心处理，去除上清，用1-10ml活化缓冲溶液B进行超声复溶，换液重复3次，得到氨基封端聚乙二醇衍生物支架-羧基胶乳微球复合物溶液，以供后续使用； 2)制备氨基封端聚乙二醇衍生物支架-羧基胶乳微球-抗体复合物 2-1)向步骤1)制备的氨基封端聚苯乙烯衍生物支架-羧基胶乳微球复合物溶液中加入5-50mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和7.5-75mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)进行活化，磁力搅拌，混合均匀； 2-2)用3000g-25000g离心处理10分钟，去除上清，用1-10ml偶联缓冲溶液进行超声复溶，换液重复3次，得到活化的复合物溶液； 2-3)将活化的复合物溶液加入到1-20ml0.25mg/ml单克隆抗体或者多克隆抗体溶液中，室温搅拌2-4小时后，混合均匀； 2-4)将0.1-0.5ml封闭液加入步骤2-3)得到的混合物溶液中； 2-5)室温搅拌1小时后，3000g-25000g离心处理，去除上清，用保护液进行超声复溶，重复3次换液，得到氨基封端聚乙二醇衍生物支架-羧基胶乳微球-抗体复合物溶液。 3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中所述的氨基封端聚乙二醇衍生物支架为单臂氨基封端聚乙二醇衍生物或多臂氨基封端聚乙二醇衍生物，所述的单臂氨基封端聚乙二醇衍生物的分子式如式I所示：其中-R基为甲氧基(-OCH3)、羟基(-OH)、叠氮基(-N3)、醛基(-CHO)、丙烯酸酯基团(-COCHCH2)、甲基丙烯酸酯基团(-COCCCH2CH3)、聚乳酸基团甲基氨基甲酸叔丁酯基团单臂聚乙二醇衍生物分子量(Mn)从400到20000，优选的，单臂氨基封端聚乙二醇衍生物分子量为1000、2000、3400、5000、10000、20000，更优选的，所述的单臂氨基封端聚乙二醇衍生物为甲氧基聚乙二醇胺、氨基聚乙二醇羟基、氨基聚乙二醇叠氮、氨基聚乙二醇醛基、氨基聚乙二醇丙烯酸酯、氨基聚乙二醇甲基丙烯酸酯或BOC-氨基聚乙二醇氨基；所述的多臂氨基封端聚乙二醇衍生物包括四臂氨基封端聚乙二醇衍生物、六臂氨基封端聚乙二醇氨基衍生物以及八臂氨基封端聚乙二醇氨基衍生物，多臂聚乙二醇衍生物氨基分子量(Mn)从2000到20000，优选的，多臂氨基封端聚乙二醇衍生物氨基分子量为2000、5000、10000、20000、40000；其中，四臂氨基封端聚乙二醇衍生物的分子式如式II所示：六臂氨基封端聚乙二醇氨基衍生物分子式如式III所示：八臂氨基封端聚乙二醇氨基衍生物分子式如式IV所示： 4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1-1)中，羧基胶乳微球为聚苯乙烯微球，粒径范围从50-500nm，固含量5％-10％，表面电荷电荷密度0.025-0.5meq/g，优选的，粒径范围为70-420nm，表面电荷密度0.043-0.325meq/g，活化缓冲溶液A为MES缓冲溶液，浓度为0.01-0.1M，pH为4.5-6.5；步骤1-3)中，活化缓冲溶液B为MES、MOPs或PBS缓冲溶液，浓度为0.01-0.1M，pH为4.5-6.5；步骤2-1)中，EDC和NHS或Sulfo-NHS的质量比为1：1.5，EDC与氨基封端聚乙二醇衍生物支架-羧基胶乳微球复合物的质量比为1：20到10：1；步骤2-2)中，偶联缓冲溶液为PBS缓冲溶液、MES缓冲溶液、MOPs缓冲溶液、硼酸缓冲溶液或TAPs缓冲溶液，浓度为10-100mM，pH为5.5-7.8；步骤2-3)中，单克隆抗体和多克隆抗体为羊单抗、鼠单抗、兔单抗、人单抗、驴单抗、马单抗、羊多抗、兔多抗、鼠多抗、人多抗、驴多抗、马多抗，优选的抗体为羊抗肌红蛋白(MYO)单克隆抗体，抗体与氨基封端聚乙二醇衍生物-羧基胶乳微球复合物的质量比为1：1000-1：20；步骤2-4)中，封闭液为TRIS-HCl或甘氨酸缓冲体系，浓度为5-1000mM，其中含有牛血清白蛋白的浓度为0.02-5％w/v，硫柳汞的浓度为0.2-1g/L；步骤2-5)中，保护液为PBS、TAPs、MOPs、BB或TRIS-HCl缓冲体系，pH＝5.5-8.5，浓度为10-100mM，其中含有海藻糖浓度为1-15％w/v，甘露醇浓度为2-10％w/v，牛血清白蛋白的浓度为0.1-4％w/v，TWEEN-80浓度为0.01-0.05％w/v，硫柳汞的浓度为0.2-1g/L。 5.一种通过“一步法”制备胶乳微球与抗体复合物的方法，其特征在于，所述的胶乳微球与抗体复合物为高分子支架-羧基胶乳微球-抗体复合物，包括如下步骤：将抗体与高分子支架混合均匀，与合适粒径的羧基胶乳微球进行反应，制得高分子支架-羧基胶乳微球-抗体复合物溶液。 6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1)把0.1-1ml质量百分比分数浓度为5-10％的羧基胶乳微球加入到5-10ml pH＝5.5-6.5的活化缓冲溶液B中，混合均匀，随后加入5-50mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和7.5-75mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或7.5-75mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)进行活化，磁力搅拌，混合均匀； 2)用3000g-25000g离心处理10分钟，去除上清，用pH＝6-8的偶联缓冲溶液进行超声复溶，换液重复3次，得到活化的羧基胶乳微球溶液； 3)将1-20ml0.25mg/ml单克隆抗体或者多克隆抗体溶液和0.1-10ml2％w/v高分子支架溶液加入到活化的羧基胶乳微球溶液中，室温搅拌2-4小时，混合均匀； 4)将0.1-0.5ml封闭液加入步骤3)得到的混合物溶液中； 5)室温搅拌1小时后，3000g-25000g离心处理，去除上清，用保护液进行超声复溶，重复3次换液，得到高分子支架-羧基胶乳微球-抗体复合物溶液。 7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)中，羧基胶乳微球为聚苯乙烯微球，粒径范围从50-500nm，固含量5％-10％，表面电荷电荷密度0.025-0.5meq/g，优选的，粒径为320nm，固含量10％，表面电荷密度为0.043meq/g；EDC和NHS或Sulfo-NHS的质量比为1：1.5，EDC与羧基胶乳微球的质量比为1：20到10：1；活化缓冲溶液B为MES、MOPs、PBS缓冲溶液，浓度为0.01-0.1M，pH为4.5-6.5；步骤2)中，偶联缓冲溶液为PBS缓冲溶液、MES缓冲溶液、MOPs缓冲溶液、硼酸缓冲溶液、TAPs缓冲溶液，浓度为10-100mM，pH为5.5-7.8；步骤3)中，单克隆抗体和多克隆抗体为羊单抗、鼠单抗、兔单抗、人单抗、驴单抗、马单抗、羊多抗、兔多抗、鼠多抗、人多抗、驴多抗、马多抗，优选的，抗体为羊抗肌红蛋白(MYO)单克隆抗体；步骤4)中，封闭液为TRIS-HCl或甘氨酸缓冲体系，浓度为5-1000mM，其中含有牛血清白蛋白的浓度为0.02-5％w/v，硫柳汞的浓度为0.2-1g/L；步骤5)中，保护液为PBS、TAPs、MOPs、BB、TRIS-HCl等缓冲体系，pH＝5.5-8.5，浓度为10-100mM，其中含有海藻糖浓度为1-15％w/v，甘露醇浓度为2-10％w/v，牛血清白蛋白的浓度为0.1-4％w/v，TWEEN-80浓度为0.01-0.05％w/v，硫柳汞的浓度为0.2-1g/L。 8.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中所述的高分子支架为单臂氨基封端聚乙二醇衍生物、多臂氨基封端聚乙二醇衍生物、氨基修饰葡聚糖(Dextran-Amine)、链霉亲和素、牛血清白蛋白、酪蛋白、卵清蛋白，其中，单臂氨基封端聚乙二醇衍生物、多臂氨基封端聚乙二醇衍生物的限定范围与权利要求3中相同；氨基修饰葡聚糖的分子结构式如式V所示，其分子量从6kDa-2000kDa，优选的，氨基修饰葡聚糖的分子量有6kDa、10kDa、20kDa、40kDa、70kDa、100kDa、200kDa、500kDa、2000kDa，所述高分子支架与羧基胶乳微球质量比为1：100到80：1； 9.一种胶乳微球与抗体复合物，其特征性在于，所述的胶乳微球与抗体复合物是由权利要求1-4任一项所述的方法制备得到的氨基封端聚乙二醇衍生物支架-羧基胶乳微球-抗体复合物，或是由权利要求5-8任一项所述的方法制备得到的高分子支架-羧基胶乳微球-抗体复合物。 10.权利要求9所述的胶乳微球与抗体复合物在制备胶乳增强免疫比浊法检测试剂中的用途。 11.一种免疫比浊试剂盒，含有R1试剂以及R2试剂，其特征在于，所述的R2试剂中含有由权利要求1-4任一项所述的方法制备得到的氨基封端聚乙二醇衍生物支架-羧基胶乳微球-抗体复合物溶液，或是由权利要求5-8任一项所述的方法制备得到的高分子支架-羧基胶乳微球-抗体复合物溶液。 12.如权利要求11所述的免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述的R1试剂为10-1000mmol/L的碳酸钠-碳酸氢钠(CB)、PBS、MES、TRIS-HCl、甘氨酸-盐酸、甘氨酸-强氧化钠、MOPs或TAPs缓冲溶液，pH＝3.5-8.7，其中含有牛血清白蛋白的浓度为0.2-5％w/v，酪蛋白的浓度为0.02-5％w/v，硫柳汞的浓度为0.01-0.5％w/v，TWEEN-20的浓度为0.02-0.2％w/v，PEG8000的浓度为0.3-5％w/v，氯化钠的浓度为150-2000mmol/L，异嗜性抗体阻断剂浓度为0.02-2mg/ml，优选的，所述的R1试剂为含有2％w/v牛血清白蛋白、0.2％w/v酪蛋白、0.1％w/v硫柳汞、0.05％w/vTWEEN-20、4％w/vPEG8000、150mM氯化钠以及0.1％w/v异嗜性抗体阻断剂的25mM MES缓冲溶液；优选的，所述的试剂盒还包括校准品稀释液，所述的校准品稀释液为10-200mmol/L的MES、MOPs、TAPs、BB、PBS、CB、TRIS-HCl、甘氨酸-氢氧化钠缓冲体系，pH＝4.5-8，其中含有蛋白保护剂为0.01-0.5％w/v，蔗糖浓度为0.2-15％w/v，甘露醇浓度为1-10％w/v，硫柳汞浓度为0.02-0.2％w/v，氯化钠浓度为150-2000mmol/L，TWEEN-80浓度为0.01-0.1％w/v，优选的，所述的校准品稀释液为含有5％w/v牛血清白蛋白、0.1％w/v蛋白保护剂、8％w/v蔗糖、3％w/v甘露醇、0.1％w/v硫柳汞、150mM氯化钠、0.05％w/vTWEEN-80的100mM的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液。
所属类别：	发明专利