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原文传递一种定量检测人类血浆中DPP-4酶活性的方法

专利名称：	一种定量检测人类血浆中DPP-4酶活性的方法
摘要：	本发明涉及分析检测技术领域，特别涉及一种定量检测人类血浆中DPP‑4酶活性的方法，主要包括温度平衡、加质控样品和待测样品并封板孵育、加标准样品并封板孵育、加甘氨酸‑脯氨酸‑7‑氨基‑4‑甲基香豆素氢溴酸盐并封板孵育、两次读板的操作步骤，具有检测周期短、操作便捷、检测准确灵敏的特点。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	宁波熙宁检测技术有限公司
发明人：	胡国清;祝永琴;熊垚;汤丽英
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-19T00:00:00+0800
发布日期：	2019-11-08T00:00:00+0800
申请号：	CN201910653533.2
公开号：	CN110426518A
分类号：	G01N33/573(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	315103 浙江省宁波市高新区院士路66号创业大厦2号楼460室
主权项：	1.一种定量检测人类血浆中DPP-4酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤： ①、开始实验前将各试剂和待测样品放在室温平衡； ②、加50μL/孔的质控样品和待测样品到检测孔板中，每个待测样品4个孔； ③、每个待测样品的2个孔作为对照孔，加入10μL/孔的抑制剂工作液；另外两个孔作为测试孔，加入10μL/孔1×PBS缓冲液，用封板膜封板，37℃孵育10±2min； ④、加配制好的7-氨基-4-甲基香豆素的标准样品100μL/孔到空白检测孔板中，复孔2个操作； ⑤、加40μL/孔的甘氨酸-脯氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素氢溴酸盐到质控样品和待测样品孔中； ⑥、用封板膜封板，37℃孵育10±1min后用酶标仪在Ex/Em＝355/460nm读板； ⑦、读板后用封板膜封板，37℃孵育30±2min后在Ex/Em＝355/460nm再次读板；待测样品和质控样品的DPP-4酶活性的计算方式如下：酶活性(μU/mL)＝B/((T2-T1)×V)×样品稀释倍数其中，T2-T1为第二次读板前37℃下的孵育时间，单位为min； V为加入检测孔板中的样品体积，单位为mL； B为第二次和第一次读板间产生的7-氨基-4-甲基香豆素的物质的量，单位为pmol，其计算方法为使用ΔRFU作为信号值经7-氨基-4-甲基香豆素标准曲线回算出的浓度乘以每孔的体积，其浓度单位为nM，体积单位为mL； ΔRFU＝(RT2-RB2)-(RT1-RB1) 其中，RT2和RB2分别为第二次读板时加入1×PBS缓冲液和抑制剂工作液的复孔信号值的平均值；RT1和RB1分别为第一次读板时加入1×PBS缓冲液和抑制剂工作液的复孔信号值的平均值。 2.根据权利要求1所述的一种定量检测人类血浆中DPP-4酶活性的方法，其特征在于，所述质控样品为人类K2EDTA血浆，或为人类K2EDTA血浆与1×PBS缓冲液按体积比配制的混合物。 3.根据权利要求2所述的一种定量检测人类血浆中DPP-4酶活性的方法，其特征在于，所述质控样品包括定量上限质控样品、高浓度质控样品、中间浓度质控样品、低浓度质控样品和定量下限质控样品；其中，定量上限质控样品为人类K2EDTA血浆，活性水平为170.66μU/mL；高浓度质控样品为人类K2EDTA血浆与1×PBS的混合物，活性水平为129.12μU/mL；中间浓度质控样品为人类K2EDTA血浆与1×PBS的混合物，活性水平为66.28μU/mL；低浓度质控样品为人类K2EDTA血浆与1×PBS的混合物，活性水平为44.35μU/mL；定量下限质控样品为人类K2EDTA血浆与1×PBS的混合物，活性水平为21.23μU/mL。 4.根据权利要求1所述的一种定量检测人类血浆中DPP-4酶活性的方法，其特征在于，所述标准样品为1×PBS缓冲液，或为1×PBS缓冲液与7-氨基-4-甲基香豆素中间溶液按体积比配制的混合物。 5.根据权利要求4所述的一种定量检测人类血浆中DPP-4酶活性的方法，其特征在于，所述7-氨基-4-甲基香豆素中间溶液由175.18μL浓度为1mg/mL的7-氨基-4-甲基香豆素标准溶液与824.82μL的1×PBS缓冲液混合配制而成。 6.根据权利要求5所述的一种定量检测人类血浆酶活性的方法，其特征在于，所述7-氨基-4-甲基香豆素标准溶液由0.01g7-氨基-4-甲基香豆素粉末加入10mL二甲基亚砜溶解配制而成。 7.根据权利要求1所述的一种定量检测人类血浆中DPP-4酶活性的方法，其特征在于，所述抑制剂工作液中的抑制剂为西格列汀。 8.根据权利要求7所述的一种定量检测人类血浆中DPP-4酶活性的方法，其特征在于，所述抑制剂工作液中西格列汀的浓度为20μg/mL。 9.根据权利要求1所述的一种定量检测人类血浆中DPP-4酶活性的方法，其特征在于，所述检测孔板为96孔板。 10.根据权利要求1所述的一种定量检测人类血浆中DPP-4酶活性的方法，其特征在于，所述酶标仪为EnVision酶标仪。
所属类别：	发明专利