详情

原文传递一种人血浆中维A酸的定量检测方法

专利名称：	一种人血浆中维A酸的定量检测方法
摘要：	本发明公开了一种人血浆中维A酸的定量检测方法。本发明定量检测方法包括如下步骤：标准工作溶液的配制；空白基质的处理；标准曲线及质控配制过程；血浆样品前处理过程；LC‑MS/MS测定。本发明人血浆样品前处理中使用液液‑萃取进行前处理。操作简单，处理速度快，引入误差小，分离效果好，检测效率高本发明使用适合LC‑MS/MS的色谱条件，利用反相色谱使维A酸及其异构体达到基线分离，在满足分析检测的同时也延长色谱柱和仪器的使用寿命。
专利类型：	发明专利
申请人：	山东良福制药有限公司
发明人：	余丽英;史宁;郝光涛;冯强;吕朝;张晓杰;刘文婷
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T19:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T00:00:00+0805
申请号：	CN202010059717.9
公开号：	CN111208252A
代理机构：	北京纪凯知识产权代理有限公司
代理人：	王春霞
分类号：	G01N30/88;G01N30/06;G01N30/89;G01N33/49;G;G01;G01N;G01N30;G01N33;G01N30/88;G01N30/06;G01N30/89;G01N33/49
申请人地址：	272600 山东省济南市梁山县公明路中段
主权项：	1.一种血浆中维A酸的定量检测方法，包括如下步骤： (1)采用维A酸标准品配制不同浓度的维A酸工作液；采用维A酸-D5内标配制维A酸-D5内标工作液； (2)分别将等量的不同浓度的所述维A酸工作液和所述维A酸-D5内标工作液加入至经光照处理后的人离体血浆中，经前处理后，分别进行LC-MS/MS检测，以维A酸与维A酸-D5内标的色谱峰面积的比值作为纵坐标，以加入所述维A酸工作液的人离体血浆中维A酸的浓度作为横坐标制作标准曲线； (3)在避光条件下，向待测人离体血浆中加入所述维A酸-D5内标工作液，经前处理后，进行LC-MS/MS检测，得到待测人离体血浆中维A酸与维A酸-D5内标的色谱峰面积的比值，根据所述标准曲线，即得到待测人离体血浆中维A酸的含量；所述LC-MS/MS检测的条件如下：液相条件为：色谱柱：Ultimate XS-C18；流动相A：含体积分数为0.1～0.5％甲酸的水溶液；流动相B：体积比为9：1的乙腈-甲醇溶液，含有体积分数为0.1～0.5％的甲酸；柱温箱温度：30～50℃；流速：0.2～0.8mL/mim；洗脱梯度的程序为： 0～0.50min，流动相A的体积分数为35％； 0.50～6.00mim，流动相A的体积分数由35％下降至27％； 6.00～7.00mim，流动相A的体积分数保持为35％； 7.00～7.10mim，流动相A的体积分数由27％下降至5％； 7.10～8.10mim，流动相A的体积分数保持为5％； 8.10～8.11mim，流动相A的体积分数由5％上升至35％； 8.11～9.50mim，流动相A的体积分数保持为35％；质谱条件为：离子化模式：电喷雾离子化源正离子模式；扫描模式：多反应监测检测模式；电喷雾电压：4500～5500eV；离子源温度：300～600℃；气帘气：20～40psi；碰撞池气体：4～6psi；雾化气：50～90psi；辅助加热气：50～90psi；数据采集时间：5～20min。 2.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于：步骤(2)和(3)中，所述前处理的步骤如下：采用甲基叔丁基醚或正己烷或甲基叔丁基醚与正己烷的混合液进行萃取，涡旋混匀，于2～8℃的离心机高速离心5～10min；取上清液并浓缩，浓缩挥干后加入体积含量为50～80％的甲醇水溶液或乙腈或体积比为9：1的乙腈-甲醇溶液、且含有体积分数为0.1％～0.5％的甲酸进行复溶，涡旋混匀3～5min，于2～8℃的离心机高速离心5～10min，取上清进行LC-MS/MS检测；所述离心机的转速为≥10000g的离心力。 3.根据权利要求1或2所述的定量检测方法，其特征在于：所述LC-MS/MS测定过程中，维A酸的监测离子对为m/z301.2→m/z 123.2，四极杆驻留时间为50～150ms，去簇电压60eV，碰撞能量为19eV。 4.根据权利要求1或2所述的定量检测方法，其特征在于：所述LC-MS/MS检测过程中，维A酸-D5的监测离子对为m/z 306.2→m/z 127.2，四极杆驻留时间为50～150ms，去簇电压为60eV，碰撞能量21eV。 5.根据权利要求1-4中任一项所述的定量检测方法，其特征在于：所述维A酸工作液的浓度为10～10000ng/mL，但不为零；所述维A酸-D5内标工作液的浓度为100～1000ng/mL。 6.根据权利要求1-5中任一项所述的定量检测方法，其特征在于：所述LC-MS/MS检测过程中，还包括如下质谱条件：自动进样器清洗溶液为体积比1:1的甲醇或乙腈或甲醇/乙腈水溶液；自动进样器温度：4～8℃；自动进样器清洗模式：进样前和进样后清洗；自动进样器清洗体积：300～600μL；自动进样器清洗时浸泡时间2～5s；自动进样器进样体积：10～30μL。 7.根据权利要求1-6中任一项所述的定量检测方法，其特征在于：步骤(3)中，所述人离体血浆的用量不小于200μL。
所属类别：	发明专利