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原文传递一种血浆中沃诺拉赞的定量检测方法

专利名称：	一种血浆中沃诺拉赞的定量检测方法
摘要：	本发明属于沃诺拉赞检测技术领域，公开了一种血浆中沃诺拉赞的定量检测方法，包括以下步骤：(1)标准工作溶液的配制：沃诺拉赞工作溶液及内标工作溶液均在‑20℃下保存，备用；(2)校正标样的配制：分别加入空白血浆样品，混匀，配制成多个校正标样；(3)样品处理：等体积地取多个校正标样及待测血浆样品，分别加入步骤(1)中的内标工作溶液，分别加入乙腈，混匀，离心，取上清液，保存待用；(4)LC‑MS/MS分析测定；(5)标准曲线制作(6)定量分析：按照步骤(4)，等量取待测血浆样品对应的上清液，进行LC‑MS/MS分析测定。本发明的定量检测方法具备操作简单、分离效果好、定性准确、样品分析时间短及检测灵敏度高的特点。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	湖北;42
申请人：	康诚科瑞医药研发(武汉)有限公司
发明人：	李高;熊伟
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-12T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-18T00:00:00+0800
申请号：	CN201910185418.7
公开号：	CN109900822A
代理机构：	成都顶峰专利事务所(普通合伙)
代理人：	陈夏
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	430000 湖北省武汉市东湖新技术开发区高新大道666号光谷生物创新园C6栋107-108室
主权项：	1.一种血浆中沃诺拉赞的定量检测方法，其特征在于：包括以下步骤： (1)标准工作溶液的配制：称取沃诺拉赞，加入甲醇配制成浓度为0.1～1mg·mL-1的沃诺拉赞储备液，将所述沃诺拉赞储备液用体积比为1:1的乙腈水溶液稀释成浓度为2～1000ng·mL-1的沃诺拉赞工作溶液；称取沃诺拉赞的内标物，加入体积比为1:1的甲醇水溶液配制成浓度为1～10mg·mL-1的内标储备液，用体积比为1:1的乙腈水溶液稀释成1～10ng·mL-1的内标工作溶液；所述沃诺拉赞工作溶液及所述内标工作溶液均在-20℃下保存，备用； (2)校正标样的配制：取多个不同浓度的沃诺拉赞工作溶液，分别加入空白血浆样品，混匀，配制成多个校正标样，校正标样的浓度为0.1～50ng·mL-1； (3)样品处理：等体积地取多个校正标样及待测血浆样品，分别加入步骤(1)中的内标工作溶液，分别加入乙腈，混匀，离心，取上清液，保存待用； (4)LC-MS/MS分析测定：等量取步骤(3)的多个校正标样对应的上清液，分别加入含0.2％甲酸的10mM乙酸铵水溶液，混匀，进行LC-MS/MS分析测定，得多个校正标样的沃诺拉赞和内标物的色谱图； (5)标准曲线制作：以沃诺拉赞和内标物的色谱峰面积比为纵坐标，以沃诺拉赞的血药浓度与内标物的血药浓度的比值为横坐标制作标准曲线，用加权最小二乘法进行线性回归，得回归方程Y＝a+bX； (6)定量分析：按照步骤(4)，等量取待测血浆样品对应的上清液，加入含0.2％甲酸的10mM乙酸铵水溶液，混匀，进行LC-MS/MS分析测定，得待测血浆样品的沃诺拉赞和内标物的色谱图，并按步骤(5)的回归方程计算，得到待测血浆样品中沃诺拉赞的血药浓度。 2.根据权利要求1所述的血浆中沃诺拉赞的定量检测方法，其特征在于：沃诺拉赞的内标物为卡马西平-d10。 3.根据权利要求2所述的血浆中沃诺拉赞的定量检测方法，其特征在于：步骤(3)中的离心条件为：离心温度为4℃，离心速度为4000rpm，离心时间为10min。 4.根据权利要求2所述的血浆中沃诺拉赞的定量检测方法，其特征在于：按照步骤(1)中的沃诺拉赞工作溶液的配制方式，配制浓度为2.00～750ng·mL-1的沃诺拉赞平行工作溶液，按照步骤(2)，取多个不同浓度的沃诺拉赞平行工作溶液，分别加入空白血浆样品，混匀，分别配制成不同浓度的质控样品，再将质控样品按照步骤(3)及步骤(4)进行处理，得质控样品的沃诺拉赞和内标物的色谱图。 5.根据权利要求4所述的血浆中沃诺拉赞的定量检测方法，其特征在于：LC-MS/MS测定过程的工作条件为： a.液相色谱条件：4.6×100mm的色谱柱；流动相A为浓度为0.2％的甲酸和浓度为10mM的乙酸铵水溶液的混合物；流动相B为乙腈；柱温箱温度为40℃；流速为0.2～0.8mL/min；洗脱方式为等梯度洗脱； b.质谱条件：离子源为ESI源，采用正离子模式及多反应监测模式；电喷雾电压为4500V；涡旋离子喷雾温度为500℃；气帘气的压力为30psi；雾化气的压力为60psi；辅助气的压力为70psi；数据收集时间为2.5min。 6.根据权利要求5所述的血浆中沃诺拉赞的定量检测方法，其特征在于：所述液相色谱条件还包括：自动进样器的清洗溶液为体积比为1:1的甲醇水溶液；自动进样器的温度为4℃；自动进样器的清洗模式为进样前清洗和进样后清洗；自动进样器的洗针体积为500μL；自动进样器进样针清洗时的浸泡时间为2s；自动进样器的进样体积为5μL。 7.根据权利要求6所述的血浆中沃诺拉赞的定量检测方法，其特征在于：质谱条件中的沃诺拉赞监测离子对为346.1/315.1，去簇电压为60V，碰撞能量为16eV。 8.根据权利要求7所述的血浆中沃诺拉赞的定量检测方法，其特征在于：质谱条件中的卡马西平-d10监测离子对为247.2/204.1，去簇电压为60V，碰撞能量为26eV。 9.根据权利要求1-8任一项所述的血浆中沃诺拉赞的定量检测方法，其特征在于：所述沃诺拉赞储备液的浓度为0.5mg·mL-1，所述内标储备液的浓度为1mg·mL-1，所述沃诺拉赞工作溶液的数量为八个，八个沃诺拉赞工作溶液的浓度分别为2、4、20、100、300、600、900及1000ng·mL-1，所述内标工作溶液的浓度为1ng·mL-1。
所属类别：	发明专利