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原文传递一种赭曲霉毒素A的比率电化学检测方法

专利名称：	一种赭曲霉毒素A的比率电化学检测方法
摘要：	本发明属于生物传感技术领域，涉及一种检测赭曲霉毒素A的比率电化学适配体传感器的制备方法，并将其用于检测赭曲霉毒素A(OTA)。该比率传感策略通过在金电极上顺序修饰二茂铁标记的互补DNA(Fc‑cDNA)，赭曲霉毒素A适配体(Aptamer)以及一个辅助互补DNA(hDNA)而构建，利用目标诱导的构象变化输出双电流信号IFc和IMB(分别为Fc和MB的氧化电流)，并使用两者的比率信号(IFc/IMB)量化和检测OTA。获得的比率电化学适配体传感器可实现对OTA的高灵敏、高可靠性检测，检测线性范围为10pg/mL‑10ng/mL，检出限为3.3pg/mL。本发明旨在发展一种灵敏度高、选择性好、可靠性高的比率电化学适配体传感器，为测定实际样品中的OTA提供可靠的传感平台。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	江苏大学
发明人：	由天艳;朱成喜;刘东;李玉叶;申秀丽
专利状态：	有效
申请日期：	2019-08-28T00:00:00+0800
发布日期：	2019-12-27T00:00:00+0800
申请号：	CN201910802150.7
公开号：	CN110618185A
分类号：	G01N27/48(2006.01);G;G01;G01N;G01N27
申请人地址：	212013 江苏省镇江市京口区学府路301号
主权项：	1.一种赭曲霉毒素A的比率电化学检测方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)将金电极AuE依次用不同粒径的三氧化二铝粉末打磨，并依次在乙醇和水中超声以清除表面残留，然后在硫酸溶液中使用循环伏安对电极进行电化学清洗； (2)将二茂铁标记的互补DNA即Fc-cDNA修饰到经步骤(1)处理的电极上，利用Au-S键将Fc-cDNA固定在金电极表面； (3)将巯基己醇MCH修饰在步骤(2)处理过的电极上，以封闭金的非特异性结合位点； (4)将赭曲霉毒素A的适配体Aptamer修饰在步骤(3)处理过的电极上，利用其与cDNA的杂交反应形成双链DNA； (5)将辅助互补DNA即hDNA修饰在步骤(4)处理过的电极上，利用杂交反应进一步形成更长的双链DNA； (6)将步骤(5)得到的电极浸泡在不同浓度的赭曲霉毒素A的标准溶液中，超纯水冲洗后在室温下自然晾干； (7)将步骤(6)得到的电极浸泡在亚甲蓝MB溶液中，超纯水冲洗后在室温下自然晾干，记为MB/OTA/hDNA/Apt/MCH/Fc-cDNA/AuE-1；在三电极体系中，将得到的电极MB/OTA/hDNA/Apt/MCH/Fc-cDNA/AuE-1作为工作电极，Ag/AgCl(饱和KCl)电极为参比电极，铂丝为对电极，以磷酸盐缓冲溶液为电解液，进行电化学交流伏安曲线测量，检测比率信号IFc/IMB，建立赭曲霉毒素A溶液浓度与比率信号IFc/IMB的对应关系的标准线性曲线； (8)待测样品中赭曲霉毒素A浓度的检测：将步骤(5)得到的电极浸泡在赭曲霉毒素A的待测溶液中，超纯水冲洗后在室温下自然晾干；然后再浸泡在亚甲蓝MB溶液中，超纯水冲洗后在室温下自然晾干，记为MB/OTA/hDNA/Apt/MCH/Fc-cDNA/AuE-2；在三电极体系中，将得到的电极MB/OTA/hDNA/Apt/MCH/Fc-cDNA/AuE-2作为工作电极，Ag/AgCl(饱和KCl)电极为参比电极，铂丝为对电极，以磷酸盐缓冲溶液为电解液，进行电化学交流伏安曲线测量，检测比率信号IFc/IMB，代入步骤(7)建立的标准线性曲线中，得到待测溶液中赭曲霉毒素A的浓度。 2.根据权利要求1所述的赭曲霉毒素A的比率电化学检测方法，其特征在于，步骤(1)中，金电极的直径d＝3mm；所用的三氧化二铝粉末的粒径依次为0.3μm和0.05μm；所述循环伏安的扫描速率为100mV/s，扫描电位范围为-0.2-1.6V，硫酸的浓度为0.1M。 3.根据权利要求1所述的赭曲霉毒素A的比率电化学检测方法，其特征在于，步骤(2)中，Fc-cDNA的用量为6μL，浓度为1μM，修饰时间为室温下8小时。 4.根据权利要求1所述的赭曲霉毒素A的比率电化学检测方法，其特征在于，步骤(3)中，MCH的用量为6μL，浓度为1mM，孵育时间为室温下1小时。 5.根据权利要求1所述的赭曲霉毒素A的比率电化学检测方法，其特征在于，步骤(4)中，Aptamer的用量为6μL，浓度为2μM，反应时间为1小时，温度37℃。 6.根据权利要求1所述的赭曲霉毒素A的比率电化学检测方法，其特征在于，步骤(5)中，hDNA的用量为6μL，浓度为2μM，反应时间为1小时，温度37℃。 7.根据权利要求1所述的赭曲霉毒素A的比率电化学检测方法，其特征在于，步骤(6)中，电极浸泡的时间为40分钟，赭曲霉毒素A的标准溶液的浓度为1×10-11～1×10-8g/mL。 8.根据权利要求1所述的赭曲霉毒素A的比率电化学检测方法，其特征在于，步骤(7)中，MB的浓度为2μM，浸泡时间为10分钟；磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01M，pH为7.4；ACV测量的电位范围为-0.5-0.7V，频率为25Hz。 9.根据权利要求1所述的赭曲霉毒素A的比率电化学检测方法，其特征在于，步骤(8)中，电极浸泡在赭曲霉毒素A的待测溶液中浸泡的时间为40分钟；MB的浓度为2μM，浸泡在MB中的时间为10分钟；磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01M，pH为7.4；ACV测量的电位范围为-0.5-0.7V，频率为25Hz。
所属类别：	发明专利