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原文传递一种新的糖蛋白完整O-糖肽定量分析方法

专利名称：	一种新的糖蛋白完整O-糖肽定量分析方法
摘要：	本发明提供了一种糖蛋白完整O‑糖肽定量分析方法，包括以下步骤：(1)糖蛋白加热变性后，进行还原烷基化处理，打开糖蛋白的二硫键并烷基化封闭；(2)N‑糖链去除：在超滤管中使用PNGase F蛋白酶切除糖肽上的N‑糖链，离心去除N‑糖链；(3)获得肽段：在超滤管中使用胰蛋白酶将蛋白质酶切成肽段，离心即得肽段；(4)亲水作用色谱纯化：HILIC填料结合肽段，洗涤除杂，再洗脱得O‑糖肽；(5)使用LC‑MS/MS分析完整O‑糖肽；(6)使用Xcalibur定性定量分析完整O‑糖肽。本发明能简单、有效地实现糖肽相对定量，具有良好的应用前景。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	四川;51
申请人：	四川大学华西医院
发明人：	张勇;杨浩;程惊秋
专利状态：	有效
申请日期：	2019-01-10T00:00:00+0800
发布日期：	2019-04-26T00:00:00+0800
申请号：	CN201910025651.9
公开号：	CN109682911A
代理机构：	成都高远知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	李高峡;张娟
分类号：	G01N30/88(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	610000 四川省成都市武侯区国学巷37号
主权项：	1.一种糖蛋白完整O-糖肽定量分析前处理方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)糖蛋白加热变性后，进行还原烷基化处理，打开糖蛋白的二硫键并烷基化封闭； (2)N-糖链去除：在超滤管中使用PNGase F蛋白酶切除糖肽上的N-糖链，离心去除N-糖链； (3)获得肽段：在超滤管中使用胰蛋白酶将蛋白质酶切成肽段，离心即得肽段； (4)亲水作用色谱纯化：HILIC填料结合肽段，洗涤除杂，再洗脱得O-糖肽。 2.如权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，步骤(1)所述还原烷基化处理是使用终浓度15-25mmol/L的二硫苏糖醇在50-60℃振荡反应0.5-1h，加入终浓度40-60mmol/L碘乙酰胺在室温避光反应0.5-2h；优选地，步骤(1)所述二硫苏糖醇的终浓度是20mmol/L，碘乙酰胺的终浓度是50mmol/L。 3.如权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，步骤(2)所述酶切反应遵照如下参数：酶用量：每20μg糖蛋白使用1U的酶；反应温度：37℃；反应时间：2h。 4.如权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，步骤(2)和/或步骤(3)所述超滤管的过滤孔径是30KD。 5.如权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，步骤(1)、(2)和/或(3)的反应环境中还有含有30-70mmol/L的碳酸氢铵；优选地，含有50mmol/L的碳酸氢铵。 6.如权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，步骤(4)所述HILIC填料是博纳爱杰尔的Venusil HILIC填料。 7.如权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，步骤(4)所述结合是在室温旋转结合2h。 8.如权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，步骤(4)所述洗涤除杂所用流动相为水、乙腈、三氟乙酸的混合液，体积比按前述顺序为：(10～30)∶(70～90)∶0.2；优选地，体积比按前述顺序为20∶80∶0.2。 9.如权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，步骤(4)所述的洗脱时用0.1％(v)三氟乙酸溶液洗脱。 10.一种糖蛋白完整O-糖肽定量分析方法，其特征在于，它包括权利要求1-7任一所述的前处理方法，它还包括： a.使用LC-MS/MS分析完整O糖肽； b.使用Xcalibur软件定量分析完整O糖肽。 11.如权利要求10所述的分析方法，其特征在于，步骤a所述的LC-MS/MS的色谱条件为：色谱柱：Magic C18柱；流动相A液：0.1％(v)三氟乙酸的水溶液；流动相B液：0.1％(v)三氟乙酸的乙腈溶液；流动相B的线性梯度：6～32％；流动相的流速：0.6μL/min。 12.如权利要求10所述的分析方法，其特征在于，步骤a所述的LC-MS/MS中使用的质谱仪碎裂模式为EThcD，时间为78min，流速为0.6μL/min。一级质谱离子扫描的质量范围为800～2000Da，分辨率为6000，AGC为1e6，最大IT为50ms；二级质谱TopN设置为20，AGC为5e4，最大IT为150ms，循环时间为3s。 13.如权利要求10所述的分析方法，其特征在于，步骤b的分析步骤包含： a.手工累计MS1谱图，生成去卷积后的质谱图； b.将电荷状态归一到单电荷，去除单同位素峰以外的其它同位素峰，得到肽段信号； c.生成信号列表，根据Y1值，计算肽段质量； d.用上述单同位素峰质量减去肽段质量，即为候选的糖型；去卷积后的峰强度对应前述糖型的丰度。
所属类别：	发明专利