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原文传递阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的早期诊断、预测生物标志物组合、应用及其测定方法

专利名称：	阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的早期诊断、预测生物标志物组合、应用及其测定方法
摘要：	本发明公开了用于阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的早期诊断、预测生物标志物组合，应用及其测定方法，包括花生四烯酸，胸腺嘧啶，亚油酸，棕榈酸，棕榈油酸，肉豆蔻酸，岩芹酸，甘氨石胆酸，胆酸，去氧胆酸及其组合作为阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的早期发现、诊断和预测的生物标志物、应用及测定方法。本发明的技术方案采用阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍患者的血清(或血浆)进行液相/气相色谱质谱联用分析方法。本发明技术方案的诊断标志物可制备成试剂盒，检测方法具有高灵敏度和高特异性的特点，对于轻度老年认知障碍诊断也具有较高的灵敏度和特异性。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	广东;44
申请人：	马红华
发明人：	马红华
专利状态：	有效
申请日期：	2019-02-25T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-03T00:00:00+0800
申请号：	CN201910137465.4
公开号：	CN109709235A
代理机构：	北京权智天下知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	王新爱
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	518000 广东省深圳市龙华区龙华街道清华社区青龙路6号港之龙科技园E栋501D1
主权项：	1.一种阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍早期诊断、预测的生物标志物组合，其特征在于，该生物标志物组合为血清或血浆代谢物，包括2-氨基己二酸(2-Aminoadipic acid)，2-丁烯二酸(2-Butenedioic acid)，4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸(4,7,10,13,16,19-Docosahexaenoic acid)，5-羟脯氨酸(5-Oxoproline)，6-氨基己酸(6-Aminocaproicacid)，肾上腺酸(Adrenic acid)，阿拉伯呋喃糖(Arabinofuranose)，花生四烯酸(Arachidonic acid)，丁二酸(Butanedioic acid)，顺式-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸(cis-5,8,11,14,17-Eicosapentaenoic acid)，柠檬酸(Citric acid)，胱氨酸(Cystine)，胞苷(Cytidine)，二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid)，乙二酸(Elaidic acid)，果糖(Fructose)，葡萄糖酸(Gluconic acid)，谷氨酸(Glutamic acid)，谷氨酰胺(Glutamine)，甘油磷酸(Glycerolphosphate)，牛磺酸(Hypotaurine)，次黄嘌呤(Hypoxanthine)，异亮氨酸(Isoleucine)，亚油酸(Linoleic acid)，苹果酸(Malic acid)，甘露糖(Mannose)，N，N-二甲基甘氨酸(N,N-dimethylglycine)，十八烷酸(Octadecanoic acid)，油酸(Oleicacid)，棕榈酸(Palmitic acid)，棕榈油酸(Palmitoleic acid)，十五烷酸(Pentadecanoicacid)，脯氨酸(Proline)，山梨糖(Sorbose)，牛磺酸(Taurine)，十四烷酸(Tetradecanoicacid)，胸腺嘧啶(Thymine)，创伤性酸(Traumatic acid)，尿苷(Uridine)，木糖醇(Xylitol)，肉豆蔻酸(Myristic acid)，岩芹酸(Petroselinic acid)，甘氨石胆酸(GLCA)，去氧胆酸/胆酸(DCA/CA)，胆酸(CA)，牛磺去氧胆酸(TDCA)，牛磺石胆酸(TLCA)，甘氨去氧胆酸(GDCA)，去氧胆酸(DCA)，甘氨去氧胆酸/胆酸(GDCA:CA)，牛磺去氧胆酸/胆酸(TDCA:CA)，甘氨石胆酸/鹅去氧胆酸(GLCA:CDCA)中的一种或多种的组合。 2.如权利要求1所述的阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的早期诊断、预测生物标志物组合的应用，其特征在于，用于检测阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍患者血清或血浆的试剂盒。 3.如权利要求2所述阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的早期诊断、预测生物标志物组合的应用，其特征在于，所述试剂盒包含花生四烯酸(Arachidonic acid)，胸腺嘧啶(Thymine)，亚油酸(Linoleic acid)，棕榈酸(Palmitic acid)，棕榈油酸(Palmitoleicacid)，肉豆蔻酸(Myristic acid)，岩芹酸(Petroselinic acid)，甘氨石胆酸(GLCA)，胆酸(CA)，去氧胆酸(DCA)的标准溶液和一种内标标准溶液，所述内标标准溶液指同位素标记的诊断标志物棕榈酸(Palmitic acid)，棕榈油酸(Palmitoleic acid)，肉豆蔻酸(Myristicacid)，岩芹酸(Petroselinic acid)，甘氨石胆酸(GLCA)，胆酸(CA)，去氧胆酸(DCA)，同位素标记方式可以是2H或13C，试剂盒还包含萃取液，萃取液由甲醇和乙腈组成，甲醇和乙腈的体积比为：1：1-5：1，试剂盒还包含700μL的96孔板、350μL的V型96孔板、封板硅胶、96孔密封铝膜，试剂盒还包含一个随机森林模型，通过测定受试体的生物样本中代谢物水平并将这些测定值输入随机森林模型得到截断值进行判别。 4.如权利要求1所述的阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的早期诊断、预测生物标志物组合的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，取阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍病人临床血清或血浆样本；步骤2，通过色谱质谱联用分析方法分析鉴定阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍病人临床血清或血浆样本中的代谢物；步骤3，将步骤2中测定得到的生物标志物的浓度输入随机森林模型进行计算，按照分值对受试体进行判定。 5.如权利要求4所述的阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的早期诊断、预测生物标志物组合的测定方法，其特征在于，所述步骤2中的色谱质谱联用代谢组学分析方法包括液相/气相色谱质谱联用代谢组学分析方法。 6.如权利要求5所述的阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的早期诊断、预测生物标志物组合的测定方法，其特征在于，所述步骤2中气相色谱质谱联用测试的色谱条件包括：Rxi-5ms毛细管柱，载气：超纯氦气，流量：1.0mL/min，进样口温度：260℃，传输线温度：260℃，离子源温度：210℃，进样量：1uL，进样方式：不分流进样，升温程序：从80℃开始并持续3min，以10℃/min的升温速度升至220℃，之后以5℃/min的升温速度升至240℃，再以25℃/min的升温速度升至290℃，最后在290℃持续9min，质谱离子源：EI源，电子轰击能量：70eV，质谱扫描范围：m/z，40-600，全扫描方式。 7.如权利要求5所述的阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的早期诊断、预测生物标志物组合的测定方法，其特征在于，所述步骤2中液相色谱质谱联用测试的色谱条件包括：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱或者WatersUPLC BEH C18色谱柱，柱温：30℃，流动相A：含0.1％甲酸的水，B：含0.1％甲酸的乙腈，流动相洗脱梯度为0-25min：1-100％B，流速：0.4mL/min，进样量：5μL，飞行时间质谱优化条件为：(1)正离子模式(ES+)，毛细管电压3500V，喷雾器45psig，干燥气温度325℃，干燥器流速11L/min；(2)负离子模式(ES-)，毛细管电压3000V，其他参数与正离子模式一致。 8.如权利要求5所述的阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的早期诊断、预测生物标志物组合的测定方法，其特征在于，所述步骤2中气相色谱质谱联用测试的血清或血浆样本前处理包括：取50μL血清或血浆，加入10ul，0.1mg/mL，水溶的氯苯丙氨酸和10μL，1mg/mL，醇溶的十七酸作为内标来监测样本的重现性；再加入175μL，v/v＝1:3的氯仿甲醇混合溶剂，涡旋振荡30s；置离心管于-20℃放置10min以促进蛋白沉淀；然后13000rpm离心10min，取上清200μL于高回收进样瓶中，室温下真空干燥得到样本品。 9.如权利要求5所述的阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的早期诊断、预测生物标志物组合的测定方法，其特征在于，所述步骤2中样本品经抽干后使用两步法进行衍生，首先加入50μL，15mg/mL，吡啶溶的甲氧胺，涡旋振荡30s，在30℃下反应90min，然后再加入50μL，含1％TMCS的BSTFA在70℃反应60min，静置后进行GC-TOFMS分析。 10.如权利要求5所述的阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的早期诊断、预测生物标志物组合的测定方法，其特征在于，所述步骤2中液相色谱质谱联用测试的血清或血浆样本前处理包括：取50μl血清或血浆样本，加入200μL，v:v＝1:9的甲醇乙腈混合溶剂，涡旋振荡2min；置离心管于-20℃放置10min以促进蛋白沉淀，12000rpm4℃离心15min，取上清20μL，室温下真空干燥，在干燥后的离心管中加入100μL甲醇水混合溶剂复溶后分析，所述甲醇水混合溶剂的v:v＝1:1，含1μg/mL二氯苯丙氨酸作为内标。
所属类别：	发明专利