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原文传递一种大西洋鲑和虹鳟的质谱鉴别方法

专利名称：	一种大西洋鲑和虹鳟的质谱鉴别方法
摘要：	本发明公开了一种大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，包括如下步骤：a)获取大西洋鲑的氨基酸序列；b)获取虹鳟的氨基酸序列；c)利用特异性的酶解方法将待检测蛋白质切成小分子量的多肽片段混合物，利用静电场轨道阱高分辨质谱全扫描模式检测混合物中各多肽的分子量和碎片信息，并与前面获取的氨基酸序列进行比对，定性判断是否存在大西洋鲑和虹鳟的特征肽段；d)挑选定性为大西洋鲑或虹鳟的特征肽段，利用串联四级杆质谱建立多反应监测方法进行定量分析。本发明利用蛋白质特征肽段鉴别，能够同时实现大西洋鲑和虹鳟的定性鉴定和掺假定量研究，最低检出限可达1％，灵敏度高，准确度高，抗干扰能力强，可广泛应用于大西洋鲑的真伪鉴别。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	上海;31
申请人：	上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心
发明人：	古淑青;邓晓军;方真;赵超敏;陈念念;曲栗;韩丽
专利状态：	有效
申请日期：	2019-01-24T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-03T00:00:00+0800
申请号：	CN201910069235.9
公开号：	CN109709229A
代理机构：	上海科律专利代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：	金碎平;袁亚军
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	200135 上海市浦东新区民生路1208号
主权项：	1.一种大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤： a)获取大西洋鲑和虹鳟的氨基酸序列并保存； b)利用特异性的酶解方法将待检测蛋白质切成小分子量的多肽片段混合物，利用静电场轨道阱高分辨质谱全扫描模式检测混合物中各多肽的分子量和碎片信息，并与步骤a)和b)中的氨基酸序列进行比对，实现蛋白质和多肽的鉴定； c)通过基本局部比对搜索工具与Uniprot数据库对比分析，筛选出大西洋鲑和虹鳟的特征肽段； d)利用三重四极杆质谱对大西洋鲑和虹鳟的特征肽段进行验证，并建立多反应监测方法进行掺假定量分析。 2.如权利要求1所述大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，其特征在于，所述步骤a)从蛋白质数据库Uniport中下载获取大西洋鲑和虹鳟的氨基酸序列，所述步骤b)和c)通过质谱结果结合分析软件确定多肽片段混合物中是否存在大西洋鲑或虹鳟的特征肽段。 3.如权利要求1所述的大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，其特征在于，所述步骤c)利用胰蛋白酶进行酶解，酶解后的样品在HPLC-Q/Orbitrap上以数据依赖采集方式获得的全扫描质谱图进行蛋白质定性确证；所述步骤d)针对每个特征肽选择5-6个离子对进行多肽混合物的多反应监测，完成蛋白质定量检测。 4.如权利要求3所述的大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，其特征在于，所述步骤c)包括： c1)称取均质后的固体试样2g，加入2mL质量百分浓度为0.1％的三氟乙酸溶液和8mL三氯甲烷溶液于50毫升离心管中，漩涡振荡器上涡旋震荡5min，进行氯仿脱脂，在4500r/min下离心3min，去除上清液，重复除脂2次，于室温减压浓缩至近干； c2)在样品中加入10mL摩尔浓度为50mmol/L三羟甲基氨基甲烷-酸盐溶液，调节控制pH值为7.2，漩涡振荡器上涡旋涡旋震荡1min，60℃水浴震荡提取1h，在10000r/min下离心5min，收集上清液备用； c3)移取200μL上述提取液于1.5mL低蛋白吸附的离心管中，加入150μL 500mmol/L碳酸氢铵溶液，10μL 500mmol/L二硫苏糖醇溶液，混匀后置75℃恒温水浴锅中孵育30min； c4)冷却至室温后，加入30μL摩尔浓度为500mmol/L碘代乙酰胺溶液，避光反应30min； c5)加入10μL摩尔浓度为100mmol/L氯化钙溶液和50μL牛胰蛋白酶溶液，充分混匀后置于37℃恒温水浴中过夜酶解； c6)加入10μL甲酸混匀，终止反应。 5.如权利要求3所述的利用蛋白质特征肽鉴别大西洋鲑和虹鳟的质谱检测方法，其特征在于，所述步骤c)蛋白质定量检测包括：选取不同类型、柱长或内径的色谱柱，记录色谱分离的变化；调节流动相流速、梯度或时间参数，记录分离效率的变化；控制柱温和试液温度，针对大西洋鲑和虹鳟的特征肽记录色谱保留时间的重现性；调节喷针位置、毛细管电压、锥孔电压、各路气体流量和温度以及碰撞能参数；采用全扫描方式观测蛋白酶解产物产生多电荷离子的排布与质量数范围。 6.如权利要求3所述的大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，其特征在于，还包括收集各种不同产地的大西洋鲑和虹鳟进行蛋白质特征肽段定性确证和定量检测，并收集不同来源的样品，获取统计结果。 7.如权利要求3所述的大西洋鲑鱼和虹鳟鱼的质谱鉴别方法，其特征在于，所述步骤c)中若检测出特征肽段GGLGSAGPTGPR、GEIGGVGANGPSGPQGGR、IGSGLVQEAAPLVDK或GDPGPGGPQGEPGAVGPAGITGDK，则定性判断混合物中存在大西洋鲑；所述步骤c)中若检测出特征肽段GDPGPGGPQGEQGVVGPAGISGDK，则定性判断混合物中存在虹鳟特征肽段。
所属类别：	发明专利