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原文传递基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法

专利名称：	基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法
摘要：	本发明公开了一种基于G‑四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法，与传统的黄体酮检测方法相比，其避免了贵重仪器的分析方法的建立；使用核酸适配体为识别元件提高了目标物检测的选择性和稳定性。将信号放大策略与电分析方法相结合，构建以黄体酮为检测对象的电化学传感新方法和新技术，提高分析的灵敏度。本发明检测黄体酮的方法更简便，更灵敏，选择性且成本效益更高，在痕量生物小分子分析中有着重要的实际意义和发展前景。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	贵州;52
申请人：	贵州大学
发明人：	刘冰倩;石维平;蔡杰;杨娅妮
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-02T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-09T00:00:00+0800
申请号：	CN201910261585.5
公开号：	CN109991297A
代理机构：	苏州国诚专利代理有限公司
代理人：	韩凤
分类号：	G01N27/327(2006.01);G;G01;G01N;G01N27
申请人地址：	550025 贵州省贵阳市花溪区贵州大学
主权项：	1.一种基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：黄体酮适配体、cDNA、H1和H2首次开盖使用前先离心，分别将其溶于二次水中配成100μM的母液，再用DNA稀释液分别稀释，4℃保存待用；步骤二：玻碳电极的打磨及清洗：用三种不同粒径的Al2O3抛光粉依次在麂皮上将玻碳电极打磨抛光；之后用丙酮、无水乙醇、二次水依次超声清洗，自然晾干待用；步骤三：通过电聚沉金的方法在步骤二处理好的玻碳电极表面沉积金纳米颗粒；步骤四：将步骤一获得的适配体溶液滴加在步骤三玻碳电极表面上进行孵育，二次水轻轻冲洗，自然晾干；然后加入巯基己醇孵育，用于封闭电极表面剩余的活性位点，二次水轻轻冲洗，自然晾干；步骤五：将步骤一获得的cDNA溶液滴加在步骤四电极表面上进行孵育，水洗、晾干；继续加上不同浓度的黄体酮目标溶液进行孵育，重复水洗、晾干操作；步骤六：在步骤五电极表面上同时加入步骤一获得的H1和H2溶液混合孵育，水洗、晾干；继续加Hemin溶液孵育，重复水洗晾干操作；步骤七：电化学检测：步骤六获得的修饰电极作为工作电极，参比电极是Ag/AgCl电极，对电极为铂电极，将三电极与电化学工作站相连接，通过示差脉冲伏安法对含有H2O2,OPD的PBS混合液进行扫描，记录电化学响应信号。 2.根据权利要求1所述的一种基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法，其特征在于，步骤一中，黄体酮适配体碱基序列为：5’-SH-TTT TTG CATCAC ACA CCG ATA CTC ACC CGC CTG ATT AAC ATT AGC CCA CCG CCC ACC CCC GCT GC-3’，cDNA碱基序列为：3’-TTG GTG GCG GGT-5’，H1碱基序列为：3’-GAG TGG GCG GAC TAATTG TAA TCG TGC TTT GCA TTA CAA TTA GTC CGC TTT GGG TTG GGC GGG ATG GGT TTCTT-5’，H2碱基序列为：5’-ACG AAA CGT AAT GTT AAT CAG GCG CTC ACC CGC CTG ATT AACATT AGC TTC TTT GGG TAG GGC GGG TTG GGT TT-3’；离心条件为10000rpm，4℃条件下离心3min；DNA稀释液为pH7.4、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液(包含1mmol/L MgCl2、1mmol/LCaCl2、5mmol/L KCl、0.14mol/L NaCl)；稀释后黄体酮适配体、cDNA、H1和H2的浓度均为10μmol/L。 3.根据权利要求1所述的一种基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法，其特征在于，步骤二中，依次用1μm、0.3μm、0.05μm不同粒径的Al2O3抛光粉打磨玻碳电极，分别顺时针磨50次，逆时针磨50次，丙酮、无水乙醇、二次水依次超声清洗时间为1min。 4.根据权利要求1所述的一种基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法，其特征在于，步骤三中，电聚沉金的方法是将步骤二中的玻碳电极浸入1.0wt％氯金酸溶液中，在-0.2V沉积电位下沉积60s，之后用循环伏安法在-0.4V～0.4V电位下进行扫描直至获得稳定的电流响应信号，即得表面沉积了金纳米颗粒的玻碳电极。 5.根据权利要求1所述的一种基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法，其特征在于，步骤四中，黄体酮适配体浓度为10μmol/L，用量为4μL，4℃下孵育12h；巯基己醇浓度为10mmol/L，用量为4μL，25℃下孵育30min。 6.根据权利要求1所述的一种基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法，其特征在于，步骤五中，cDNA的浓度为10μmol/L,用量为4μL，25℃下孵育2h；不同浓度的黄体酮溶液的用量为4μL，25℃下孵育2h。 7.根据权利要求1所述的一种基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法，其特征在于，步骤六中，H1和H2浓度均为10μmol/L,用量均为2μL，25℃下孵育2h；Hemin浓度为0.3mmol/L，用量为4μL，25℃下孵育2h。 8.根据权利要求1所述的一种基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法，其特征在于，步骤七中，示差脉冲伏安法的扫描电位范围为0V～-0.6V；混合液为pH7.5、0.1mol/L PBS缓冲液(含0.003mol/L H2O2,0.018mol/L OPD)，混合液用量为3mL。
所属类别：	发明专利